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丫头7976

铜虫 (正式写手)

应助: 8 (幼儿园)
金币: 103.8
帖子: 799
在线: 216.6小时
虫号: 765213

[交流] 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题

大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系，和25ul体系都做过，只是做转化时平板都没有长菌，最可能的原因就是没连上吧，还有连接时的目的片段与载体的摩尔比是3-10:1，我不知道这个该怎么算，换算成体积该怎么加，请做过酶切连接并转化的有经验的大侠指教，我将不胜感激。诸位新年快乐，心想事成。

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1楼 2011-01-01 17:15:59

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charles08

铁杆木虫 (著名写手)

应助: 9 (幼儿园)
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在线: 602.2小时
虫号: 823046

引用回帖:

4楼: Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以 ...

我做的经常有斑，也很均匀，但是质粒酶切总是找不到目的基因，这是为何？
如何消除这种假阳性？

我用PCR快速验证法总是扩不出来，用载体引物都扩不出