应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题
111/1返回列表
查看: 1945  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

丫头7976

铜虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题

大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系，和25ul体系都做过，只是做转化时平板都没有长菌，最可能的原因就是没连上吧，还有连接时的目的片段与载体的摩尔比是3-10:1，我不知道这个该怎么算，换算成体积该怎么加，请做过酶切连接并转化的有经验的大侠指教，我将不胜感激。诸位新年快乐，心想事成。
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:

» 抢金币啦！回帖就可以得到:

查看全部散金贴
1楼 2011-01-01 17:15:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:20:40
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:56:41
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积，那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题么？
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2011-01-01 17:30:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
还有就是连接酶用的哪家的？
赞一下 回复此楼
3楼2011-01-01 17:31:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:21:01
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:58:57
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以稍微长一些，虽说会出现假阳性，但是你可以用pcr快速验证一下滴！祝实验顺利！
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2011-01-01 18:14:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:30:25:
http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积，那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题 ...

普洛麦格的说明可以参考一下，不过并不总是这样子的！
赞一下 回复此楼
5楼2011-01-01 18:15:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

srlee

铁杆木虫 (小有名气)
丫头7976(金币+1):谢谢啊 2011-01-02 09:08:20
引用回帖:
Originally posted by 丫头7976 at 2011-01-01 17:15:59:
大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系 ...

这又是大载体小片段的连接问题，不是很好连，但能连的上。
把载体浓度放小一点，目的片段浓度大一点，应该没问题的！
赞一下 回复此楼
6楼2011-01-01 19:54:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

junyanski

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5):鼓励新虫交流 2011-01-01 21:21:17
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:55:51
嗯 类似这种情况我们也遇到过 不过是做的ta克隆 最后发现是氨苄板出了问题 换了试剂就长出来了 不知道楼主有没有做过阳性转化对照来看 如果也长不出就要怀疑是不是板出了问题
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2011-01-01 20:29:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

jerry110

新虫 (小有名气)
丫头7976(金币+1): 2011-01-02 08:56:05
路过，看看评论，学了不少东西，呵呵
赞一下 回复此楼
8楼2011-01-01 20:47:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丫头7976

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by brightfuture01 at 2011-01-01 17:31:01:
还有就是连接酶用的哪家的？

连接酶是宝生物的，我不能确定切没切开，做了双酶切后就连接转化了，多谢提点啊
赞一下 回复此楼
9楼2011-01-02 08:58:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

丫头7976

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29:
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可 ...

就是跑电泳后在紫外灯下看，目的条带的亮度和marker的亮度差不多，因为量太少，我不能测，只能估计一下，大概每5ul有50ng，
多谢提点啊
赞一下 回复此楼
10楼2011-01-02 09:00:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

charles08

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 天使托 at 2011-01-01 18:14:29
什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以 ...

我做的经常有斑，也很均匀，但是质粒酶切总是找不到目的基因，这是为何？
如何消除这种假阳性？

我用PCR快速验证法总是扩不出来，用载体引物都扩不出
赞一下 回复此楼
11楼2013-11-06 14:41:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 丫头7976 的主题更新
111/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 274求调剂 +7 S.H1 2026-03-18 7/350 2026-03-20 11:11 by Delta2012
[考研] 【考研调剂】化学专业 281分，一志愿四川大学，诚心求调剂 +6 吃吃吃才有意义 2026-03-19 6/300 2026-03-20 10:47 by 尽舜尧1
[考研] 一志愿武汉理工材料工程专硕调剂 +7 Doleres 2026-03-19 7/350 2026-03-20 10:39 by EBSD
[考研] 085700资源与环境308求调剂 +10 墨墨漠 2026-03-18 10/500 2026-03-20 10:35 by 无际的草原
[考研] 本人考085602 化学工程 专硕 +17 不知道叫什么！ 2026-03-15 19/950 2026-03-19 15:06 by 尽舜尧1
[考研] 一志愿西安交通大学材料工程专业 282分求调剂 +5 枫桥ZL 2026-03-18 7/350 2026-03-19 14:52 by 功夫疯狂
[考研] 0703化学调剂 +5 pupcoco 2026-03-17 8/400 2026-03-19 13:58 by houyaoxu
[考研] 一志愿福大288有机化学，求调剂 +3 小木虫200408204 2026-03-18 3/150 2026-03-19 13:31 by houyaoxu
[考研] 0703化学 305求调剂 +4 FY_yy 2026-03-14 4/200 2026-03-19 05:54 by anny19840123
[考研] 344求调剂 +6 knight344 2026-03-16 7/350 2026-03-18 20:13 by walc
[考研] 08工科 320总分 求调剂 +5 梨花珞晚风 2026-03-17 5/250 2026-03-18 14:49 by haxia
[考研] 070300化学319求调剂 +6 锦鲤0909 2026-03-17 6/300 2026-03-18 13:22 by Iveryant
[考研] 0703化学336分求调剂 +6 zbzihdhd 2026-03-15 7/350 2026-03-18 09:53 by zhukairuo
[硕博家园] 湖北工业大学 生命科学与健康学院-课题组招收2026级食品/生物方向硕士 +3 1喜春8 2026-03-17 5/250 2026-03-17 17:18 by ber川cool子
[考研] 302求调剂 +4 小贾同学123 2026-03-15 8/400 2026-03-17 10:33 by 小贾同学123
[考研] 278求调剂 +3 Yy7400 2026-03-13 3/150 2026-03-17 08:24 by laoshidan
[考研] 26考研一志愿中国石油大学(华东)305分求调剂 +3 嘉年新程 2026-03-15 3/150 2026-03-15 13:58 by 哈哈哈哈嘿嘿嘿
[考研] 288求调剂 +4 奇点0314 2026-03-14 4/200 2026-03-14 23:04 by JourneyLucky
[考研] 080500，材料学硕302分求调剂学校 +4 初识可乐 2026-03-14 5/250 2026-03-14 21:08 by peike
[考研] 297一志愿上交085600求调剂 +5 指尖八千里 2026-03-14 5/250 2026-03-14 17:26 by a不易
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭