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丫头7976

铜虫 (正式写手)

应助: 8 (幼儿园)
金币: 103.8
帖子: 799
在线: 216.6小时
虫号: 765213

[交流] 【求助/交流】关于酶切连接转化的问题

大家好，我最近在做酶切，连接，转化，载体是PET-30a大概5420bp 进行了双酶切，切胶纯化，目的片段是300bp双酶切切胶纯化，纯化后i跑了电泳，亮度跟marker差不多，连接时我是目的片段与载体各1ul，酶1ul，6ul体系，和25ul体系都做过，只是做转化时平板都没有长菌，最可能的原因就是没连上吧，还有连接时的目的片段与载体的摩尔比是3-10:1，我不知道这个该怎么算，换算成体积该怎么加，请做过酶切连接并转化的有经验的大侠指教，我将不胜感激。诸位新年快乐，心想事成。

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1楼 2011-01-01 17:15:59

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junyanski

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 23.6
帖子: 4
在线: 1.8小时
虫号: 942080

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5):鼓励新虫交流 2011-01-01 21:21:17
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:55:51

嗯类似这种情况我们也遇到过不过是做的ta克隆最后发现是氨苄板出了问题换了试剂就长出来了不知道楼主有没有做过阳性转化对照来看如果也长不出就要怀疑是不是板出了问题

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7楼2011-01-01 20:29:08

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:20:40
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:56:41

http://www.promega.com/tbs/9pim180/9pim180.pdf

看看这个里面的摩尔数怎么计算吧。没必要做25ul那么大的连接体系。

至于体积，那是和你的DNA浓度相关的。

你确定感受态、及酶切都不存在问题么？

赞一下(1人)

2楼2011-01-01 17:30:25

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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)

还有就是连接酶用的哪家的？

3楼2011-01-01 17:31:01

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天使托

专家顾问 (职业作家)

★ ★
dhd997(金币+2):good，希望你继续加油哦，这几天出台下次VIP奖励制度 2011-01-01 21:21:01
丫头7976(金币+2): 2011-01-02 08:58:57

什么叫跟marker一般亮？你没有做过定量吗？就是把你酶切纯化以后的质粒和基因定量，然后再确定连接的量，不过连接我们一般都是10ul的量，目的基因量多一些，如果没有长的话那肯定就是没有连接上了，不过连接时间可以稍微长一些，虽说会出现假阳性，但是你可以用pcr快速验证一下滴！祝实验顺利！

赞一下(1人)

4楼2011-01-01 18:14:29

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