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chlamy

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切后未纯化连接出现的问题

各位路过的虫友：

最近在做酶切连接的实验，由于质粒太大，回收效果太差，有时就酶切后直接连接，连接载体和片段的比例为1：10，挑了40个克隆检测，全为假阳性，又做了一次比例为1：100，挑了20个克隆，发现也全部为假阳性（就是质粒又重新连接了）。请问路过的各位做过这样实验的虫友，一般挑多少才会有我要的克隆呢？还是其他原因导致我的目的片段连接不上呢？
对于酶切的结果，已经电泳检测，基本上酶切完全；

在此谢过。
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1楼 2012-04-19 16:57:56
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回帖置顶 ( 共有1个 )

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
chlamy: 回帖置顶 2012-04-20 17:29:02
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-04-24 18:40:58
引用回帖:
8楼: Originally posted by chlamy at 2012-04-19 20:35:14:
的却可能存在你说的这种情况，质粒没有完全切开，但是我的质粒全长13K，双酶切开后长12K，电泳回收时也很难跑开，回收就挺难了。
对于酶切体系，是这样的。我们取其中的少部分来做连接。通过电泳条带可以很明显 ...

载体确实不小，
1.通过电泳都可以看出一个酶切开了，就代表还是可以通过跑胶将全长及酶切后的产物分开的，况且超螺旋会小很多，做个长胶，多跑会。
2.通过生长出来的菌落判断连接效率没有道理。
3.双酶切可以分步进行，不一定要在同一种buffer中同时加两个酶，这样会提高效率。
4.防止载体自连可以去磷酸化。
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生活是面镜子~
14楼2012-04-20 13:11:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:13:50:
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？ ...

就是说酶切好了，要回收后再连接，不能直接连吗？如果检测酶切完全，应该可以直接用吧？
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4楼2012-04-19 18:59:50
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普通回帖

seahow

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:12
最好回收，否则假阳性很多的； 另外可以加上其他的酶使出现多个片段，无法重新连接。
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2楼2012-04-19 17:28:35
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:30
小丹木木: 金币+3, good 2012-04-20 13:42:37
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？此体系中混有酶切buffer，怎么能顺利进行连接反应？
3.基于以上原因，即使挑10000个菌也是一样的结果。
4.楼主可以尝试大分量的回收试剂盒来解决大质粒的回收问题。
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生活是面镜子~
3楼2012-04-19 18:13:50
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chibang1220

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 20:18:05
酶切不回收那切开的不是又连回去了吗？不明白为什么要这么做。片段大了确实不好回收，在回收时多静置可能会好点，你试试。
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人的差别在于业余时间
5楼2012-04-19 19:14:22
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chlamy

木虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by chibang1220 at 2012-04-19 19:14:22:
酶切不回收那切开的不是又连回去了吗？不明白为什么要这么做。片段大了确实不好回收，在回收时多静置可能会好点，你试试。

质粒切后长12K，用常规的时试剂盒回收时质量非常低，所以就直接酶切后连接了。为了防止其连接回去，所以加大目的片段的量（质粒：目的片段比例为1：100）。但是结果还是假阳性。
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6楼2012-04-19 20:21:18
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chibang1220

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
chlamy: 金币+1 2012-04-19 21:00:15
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-24 18:41:27
引用回帖:
6楼: Originally posted by chlamy at 2012-04-19 20:21:18:
质粒切后长12K，用常规的时试剂盒回收时质量非常低，所以就直接酶切后连接了。为了防止其连接回去，所以加大目的片段的量（质粒：目的片段比例为1：100）。但是结果还是假阳性。

我明白了。我也做过大片段回收。主要是在回收时每一次换溶液后都静置2-3分钟，效果会稍微好点，而且切胶时能刻少一点也不要多余的胶，但不能太少啊，我只是说尽量少的切多余的胶。再有就是连接时比例很重要的，不是加的越多越好，一定控制好比例，我觉得这也是个错误的地方
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人的差别在于业余时间
7楼2012-04-19 20:33:22
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chlamy

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:13:50:
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？ ...

的却可能存在你说的这种情况，质粒没有完全切开，但是我的质粒全长13K，双酶切开后长12K，电泳回收时也很难跑开，回收就挺难了。
对于酶切体系，是这样的。我们取其中的少部分来做连接。通过电泳条带可以很明显的看出已经被一个酶切开了（但是我不能保证两个酶完全酶切），如果真的不能顺利的连接的话，单酶切的产物就不会自连成功。通过我们的培养皿上的菌落，可以看出还是可以很好的连接的，当然单酶切更容易形成环状而被转到感受态中。
但是我觉得已经加大了目的基因与质粒的比例（1：100），应该可以增大目的基因与载体的连接可能性，但是假阳性还是太多。
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8楼2012-04-19 20:35:14
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chlamy

木虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by chibang1220 at 2012-04-19 20:33:22:
我明白了。我也做过大片段回收。主要是在回收时每一次换溶液后都静置2-3分钟，效果会稍微好点，而且切胶时能刻少一点也不要多余的胶，但不能太少啊，我只是说尽量少的切多余的胶。再有就是连接时比例很重要的，不 ...

好，谢谢
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9楼2012-04-19 21:00:00
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piggpi

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-20 00:18:11
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-04-20 13:43:05
质粒太大确实不好回收，你可以考虑换BAC试剂盒，我们实验室做末端测序使用效果还行。另外，酶切完应该跑胶检测，12k和13k是可以分开的，你可以试试低电压跑长胶，加上对照。连接比例不是说目的片段越多越好，比例很重要，10倍比例已经很大了。
祝成功！
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在很久很久以前
10楼2012-04-19 21:24:09
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