应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切后未纯化连接出现的问题
51/1返回列表
查看: 3585  |  回复: 18
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

chlamy

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切后未纯化连接出现的问题

各位路过的虫友：

最近在做酶切连接的实验，由于质粒太大，回收效果太差，有时就酶切后直接连接，连接载体和片段的比例为1：10，挑了40个克隆检测，全为假阳性，又做了一次比例为1：100，挑了20个克隆，发现也全部为假阳性（就是质粒又重新连接了）。请问路过的各位做过这样实验的虫友，一般挑多少才会有我要的克隆呢？还是其他原因导致我的目的片段连接不上呢？
对于酶切的结果，已经电泳检测，基本上酶切完全；

在此谢过。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-19 16:57:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

chibang1220

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 20:18:05
酶切不回收那切开的不是又连回去了吗？不明白为什么要这么做。片段大了确实不好回收，在回收时多静置可能会好点，你试试。
赞一下 回复此楼
人的差别在于业余时间
5楼2012-04-19 19:14:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 19 个回答

seahow

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:12
最好回收，否则假阳性很多的； 另外可以加上其他的酶使出现多个片段，无法重新连接。
赞一下 回复此楼
2楼2012-04-19 17:28:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:30
小丹木木: 金币+3, good 2012-04-20 13:42:37
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？此体系中混有酶切buffer，怎么能顺利进行连接反应？
3.基于以上原因，即使挑10000个菌也是一样的结果。
4.楼主可以尝试大分量的回收试剂盒来解决大质粒的回收问题。
赞一下 回复此楼
生活是面镜子~
3楼2012-04-19 18:13:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:13:50:
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？ ...

就是说酶切好了，要回收后再连接，不能直接连吗？如果检测酶切完全，应该可以直接用吧？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2012-04-19 18:59:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 19 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +6 雨打竹帘 2026-08-30 10/500 2026-08-31 09:29 by huixian257
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +6 349506619 2026-08-28 6/300 2026-08-31 08:43 by kingkocxr
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的？ +17 爱看书的可乐 2026-08-26 19/950 2026-08-31 08:28 by xiangy672
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 2026年叶企孙基金 +4 bud_bud 2026-08-27 7/350 2026-08-29 07:23 by foolishmani
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +12 Kittylucky 2026-08-27 13/650 2026-08-29 00:04 by superceng
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜？ 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 2026年8月25日国自然放榜前突然收到列入评审专家邮件，有关系吗？ +25 木水思豆 2026-08-25 28/1400 2026-08-26 14:53 by draco1987
[基金申请] 为什么国自然不能直接公布 +4 bjdxyxy 2026-08-26 4/200 2026-08-26 13:12 by qingmu1201
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 今天务委会开完了，明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候，我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 某些机构，以效率低为荣，以效率低作为存在感 +9 yuleib84 2026-08-25 10/500 2026-08-25 17:14 by alexon
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭