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wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？

各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上）
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？
各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！
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1楼 2010-12-13 09:26:52
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wmqouc

金虫 (著名写手)
怎么没人回复啊
自己顶一下，别沉了
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2楼2010-12-13 11:35:44
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？
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3楼2010-12-13 11:44:40
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-13 11:44:40:


是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？

MBP增加膜蛋白的水溶性，没有MBP很难纯化膜蛋白，其实纯化后的Western blot是有的
但是酶切后却没有，不知道为什么？
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4楼2010-12-13 15:34:03
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sqhnsd

金虫 (正式写手)
★
wmqouc(金币+1): 2010-12-14 14:58:45
dhd997(金币+1):谢谢交流 2010-12-14 15:13:16
WB做的有问题吗？比如是否转错了方向。。。抗体是否新鲜。。。
蛋白有问题吗？比如WB和考然用的是否同一管蛋白？时间一样吗？因为时间久了，没有了tag,膜蛋白容易沉淀，跑WB的嗜好自然看不到。你可以拿同样一管蛋白，一边做WB,一般考然，确定蛋白没有沉淀下去。
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5楼2010-12-13 18:50:01
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tianhuijuan

金虫 (小有名气)
wmqouc(金币+1): 2010-12-16 08:57:06
[quote]Originally posted by sqhnsd at 2010-12-13 18:50:01:
WB做的有问题吗？比如是否转错了方向。。。抗体是否新鲜。。。
蛋白有问题吗？比如WB和考然用的是否同一管蛋白？时间一样吗？因为时间久了，没有了tag,膜蛋白容易沉淀，跑WB的嗜好自然看不到。你可以拿同样一管蛋 ... [/qu
分析得很好
:
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6楼2010-12-14 14:39:25
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-12-13 18:50:01:
WB做的有问题吗？比如是否转错了方向。。。抗体是否新鲜。。。
蛋白有问题吗？比如WB和考然用的是否同一管蛋白？时间一样吗？因为时间久了，没有了tag,膜蛋白容易沉淀，跑WB的嗜好自然看不到。你可以拿同样一管蛋 ...

方向没有转错，因为酶切前的MBP-膜蛋白的WB有条带，但是同在一张膜上的酶切后的膜蛋白WB却没条带。
一抗是新配的，第一次使用。
WB和考染是同一份样品，分别点在不同的胶上，同时跑电泳，条件完全一样。
在考染的胶上，明显看出MBP-膜蛋白切开了，但是在WB上没有条带。
请问膜蛋白这么稳定吗？难道His tag丢了，His tag在膜蛋白的C端
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7楼2010-12-14 15:07:09
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-12-13 18:50:01:
WB做的有问题吗？比如是否转错了方向。。。抗体是否新鲜。。。
蛋白有问题吗？比如WB和考然用的是否同一管蛋白？时间一样吗？因为时间久了，没有了tag,膜蛋白容易沉淀，跑WB的嗜好自然看不到。你可以拿同样一管蛋 ...

方向没有转错，因为酶切前的MBP-膜蛋白的WB有条带，但是同在一张膜上的酶切后的膜蛋白WB却没条带。
一抗是新配的，第一次使用。
WB和考染是同一份样品，分别点在不同的胶上，同时跑电泳，条件完全一样。
在考染的胶上，明显看出MBP-膜蛋白切开了，但是在WB上没有条带。
请问膜蛋白这么稳定吗？难道His tag丢了，His tag在膜蛋白的C端
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8楼2010-12-16 08:57:45
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wmqouc

金虫 (著名写手)
还有，我的膜蛋白使用去污剂稳定的，去污剂（FC-14）稳定膜蛋白。
不知道去污剂会不会影响抗原抗体的相互作用，
但是如果影响的的话，酶切前的MBP-膜蛋白做WB出来条带了，而酶切后却什么都没有，why
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9楼2010-12-16 14:59:11
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
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10楼2014-07-12 00:27:24
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