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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？
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wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？

各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上）
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？
各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！
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1楼 2010-12-13 09:26:52
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-12-13 18:50:01:
WB做的有问题吗？比如是否转错了方向。。。抗体是否新鲜。。。
蛋白有问题吗？比如WB和考然用的是否同一管蛋白？时间一样吗？因为时间久了，没有了tag,膜蛋白容易沉淀，跑WB的嗜好自然看不到。你可以拿同样一管蛋 ...

方向没有转错，因为酶切前的MBP-膜蛋白的WB有条带，但是同在一张膜上的酶切后的膜蛋白WB却没条带。
一抗是新配的，第一次使用。
WB和考染是同一份样品，分别点在不同的胶上，同时跑电泳，条件完全一样。
在考染的胶上，明显看出MBP-膜蛋白切开了，但是在WB上没有条带。
请问膜蛋白这么稳定吗？难道His tag丢了，His tag在膜蛋白的C端
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7楼2010-12-14 15:07:09
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wmqouc

金虫 (著名写手)
怎么没人回复啊
自己顶一下，别沉了
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2楼2010-12-13 11:35:44
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？
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3楼2010-12-13 11:44:40
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-13 11:44:40:


是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？

MBP增加膜蛋白的水溶性，没有MBP很难纯化膜蛋白，其实纯化后的Western blot是有的
但是酶切后却没有，不知道为什么？
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4楼2010-12-13 15:34:03
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