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[交流]
【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？
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各位大侠，大家好！ 我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。 酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带 很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上） 难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？ 各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！ |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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凌波丽
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一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ： 原因分析 解决办法 1.一抗和二抗失效 1. 更换抗体；选择现用现配的工作液 2.一抗和二抗不匹配 2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物 3.发光液失效 3. 更换新的发光液 4.抗体染色不充分 4. 增加抗体浓度；延长孵育时间 5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质； 增加样品 的上样量。 6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂 6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂 7.抗体活力降低 7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配 二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。 |
10楼2014-07-12 00:27:24