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wmqouc

金虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？

各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上）
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？
各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！

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1楼2010-12-13 09:26:52

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wmqouc

金虫 (著名写手)

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还有，我的膜蛋白使用去污剂稳定的，去污剂（FC-14）稳定膜蛋白。
不知道去污剂会不会影响抗原抗体的相互作用，
但是如果影响的的话，酶切前的MBP-膜蛋白做WB出来条带了，而酶切后却什么都没有，why

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9楼2010-12-16 14:59:11

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wmqouc

金虫 (著名写手)

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怎么没人回复啊
自己顶一下，别沉了

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2楼2010-12-13 11:35:44

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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

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wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10

引用回帖:

Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？

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3楼2010-12-13 11:44:40

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