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wmqouc

金虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带,why?

各位大侠,大家好!
我现在在做膜蛋白,使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达,在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白,为了得到目的蛋白,使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是,酶切后,在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了,但是做Western blot却没有带,why?(使用His-tag,该标签在膜蛋白的C端,酶切后在膜蛋白上)
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上?
各位大侠,帮我分析一下啊,谢谢!
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wmqouc

金虫 (著名写手)


还有,我的膜蛋白使用去污剂稳定的,去污剂(FC-14)稳定膜蛋白。
不知道去污剂会不会影响抗原抗体的相互作用,
但是如果影响的的话,酶切前的MBP-膜蛋白做WB出来条带了,而酶切后却什么都没有,why
9楼2010-12-16 14:59:11
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wmqouc

金虫 (著名写手)


怎么没人回复啊
自己顶一下,别沉了
2楼2010-12-13 11:35:44
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠,大家好!
我现在在做膜蛋白,使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达,在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白,为了得到目的蛋白,使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了?
为什么要切掉MBP呢,直接做不可以吗?如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以?或者是因为带了MBP后表达的不好?
3楼2010-12-13 11:44:40
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wmqouc

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-13 11:44:40:


是否是酶切后蛋白变性了?
为什么要切掉MBP呢,直接做不可以吗?如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以?或者是因为带了MBP后表达的不好?

MBP增加膜蛋白的水溶性,没有MBP很难纯化膜蛋白,其实纯化后的Western blot是有的
但是酶切后却没有,不知道为什么?
4楼2010-12-13 15:34:03
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