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wmqouc

金虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带,why?

各位大侠,大家好!
我现在在做膜蛋白,使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达,在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白,为了得到目的蛋白,使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是,酶切后,在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了,但是做Western blot却没有带,why?(使用His-tag,该标签在膜蛋白的C端,酶切后在膜蛋白上)
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上?
各位大侠,帮我分析一下啊,谢谢!
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wmqouc

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by sqhnsd at 2010-12-13 18:50:01:
WB做的有问题吗?比如是否转错了方向。。。抗体是否新鲜。。。
蛋白有问题吗?比如WB和考然用的是否同一管蛋白?时间一样吗?因为时间久了,没有了tag,膜蛋白容易沉淀,跑WB的嗜好自然看不到。你可以拿同样一管蛋 ...

方向没有转错,因为酶切前的MBP-膜蛋白的WB有条带,但是同在一张膜上的酶切后的膜蛋白WB却没条带。
一抗是新配的,第一次使用。
WB和考染是同一份样品,分别点在不同的胶上,同时跑电泳,条件完全一样。
在考染的胶上,明显看出MBP-膜蛋白切开了,但是在WB上没有条带。
请问膜蛋白这么稳定吗?难道His tag丢了,His tag在膜蛋白的C端
8楼2010-12-16 08:57:45
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wmqouc

金虫 (著名写手)


怎么没人回复啊
自己顶一下,别沉了
2楼2010-12-13 11:35:44
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)


wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠,大家好!
我现在在做膜蛋白,使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达,在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白,为了得到目的蛋白,使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了?
为什么要切掉MBP呢,直接做不可以吗?如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以?或者是因为带了MBP后表达的不好?
3楼2010-12-13 11:44:40
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wmqouc

金虫 (著名写手)


引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-13 11:44:40:


是否是酶切后蛋白变性了?
为什么要切掉MBP呢,直接做不可以吗?如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以?或者是因为带了MBP后表达的不好?

MBP增加膜蛋白的水溶性,没有MBP很难纯化膜蛋白,其实纯化后的Western blot是有的
但是酶切后却没有,不知道为什么?
4楼2010-12-13 15:34:03
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