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wmqouc

金虫 (著名写手)

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[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？

各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上）
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？
各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！

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1楼2010-12-13 09:26:52

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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖

一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法：
      原因分析                                                                      解决办法
1.一抗和二抗失效                                                       1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                    2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                             3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                       4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的蛋白质含量太低 5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                 增加样品的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                      6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                    7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。

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10楼2014-07-12 00:27:24

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wmqouc

金虫 (著名写手)

应助: 3 (幼儿园)
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虫号: 752435

怎么没人回复啊
自己顶一下，别沉了

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2楼2010-12-13 11:35:44

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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)

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wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10

引用回帖:

Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？

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3楼2010-12-13 11:44:40

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