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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？
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查看: 2012  |  回复: 9
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wmqouc

金虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】纯化酶切后的膜蛋白做Western blot没条带，why？

各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Western blot有带
很奇怪的是，酶切后，在考马斯亮蓝染后表明麦芽糖蛋白和膜蛋白切开了，但是做Western blot却没有带，why？（使用His-tag，该标签在膜蛋白的C端，酶切后在膜蛋白上）
难道因为膜蛋白的疏水性没有转到硝酸纤维素膜上？
各位大侠，帮我分析一下啊,谢谢！
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1楼 2010-12-13 09:26:52
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
一、Western Blot实验条带没出现的原因分析及解决办法 ：
        原因分析                                                                        解决办法         
1.一抗和二抗失效                                                        1.  更换抗体；选择现用现配的工作液
2.一抗和二抗不匹配                                                     2. 更换为同种同属的同亚型的抗体底物
3.发光液失效                                                              3. 更换新的发光液
4.抗体染色不充分                                                        4. 增加抗体浓度；延长孵育时间
5.被测样品中不含有目的蛋白质或者目的 蛋白质含量太低    5. 设置阳性对照。确定标本中是否含有目的蛋白质；
                                                                                    增加样品 的上样量。
6. 溶液中有辣根过氧化物酶的抑制剂                         6.用透析和超滤除去所用溶液中如叠氮化钠之类的抑制剂
7.抗体活力降低                                                     7.在抗体活力保存时间内使用抗体；工作液现用现配
二、一抗与二抗的专一性识别检测，就是蛋白质-蛋白质相互作用检测，方法很多，免疫共沉淀、Pull down、MADLI-MS、能量转移、分子筛层析等。
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10楼2014-07-12 00:27:24
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wmqouc

金虫 (著名写手)
怎么没人回复啊
自己顶一下，别沉了
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2楼2010-12-13 11:35:44
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zhuifeng7000

至尊木虫 (著名写手)
wmqouc(金币+1): 2010-12-13 15:32:10
引用回帖:
Originally posted by wmqouc at 2010-12-13 09:26:52:
各位大侠，大家好！
我现在在做膜蛋白，使用麦芽糖蛋白融合膜蛋白在大肠杆菌表达，在纯化后得到麦芽糖蛋白融合的膜蛋白，为了得到目的蛋白，使用内切酶切掉麦芽糖蛋白。
酶切前做麦芽糖蛋白融合的膜蛋白的Weste ...

是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？
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3楼2010-12-13 11:44:40
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wmqouc

金虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by zhuifeng7000 at 2010-12-13 11:44:40:


是否是酶切后蛋白变性了？
为什么要切掉MBP呢，直接做不可以吗？如果要切掉的话当初表达的时候直接选个没有MBP的载体不可以？或者是因为带了MBP后表达的不好？

MBP增加膜蛋白的水溶性，没有MBP很难纯化膜蛋白，其实纯化后的Western blot是有的
但是酶切后却没有，不知道为什么？
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4楼2010-12-13 15:34:03
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