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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切后未纯化连接出现的问题
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chlamy

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切后未纯化连接出现的问题

各位路过的虫友：

最近在做酶切连接的实验，由于质粒太大，回收效果太差，有时就酶切后直接连接，连接载体和片段的比例为1：10，挑了40个克隆检测，全为假阳性，又做了一次比例为1：100，挑了20个克隆，发现也全部为假阳性（就是质粒又重新连接了）。请问路过的各位做过这样实验的虫友，一般挑多少才会有我要的克隆呢？还是其他原因导致我的目的片段连接不上呢？
对于酶切的结果，已经电泳检测，基本上酶切完全；

在此谢过。
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1楼 2012-04-19 16:57:56
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
chlamy: 回帖置顶 2012-04-20 17:29:02
西瓜: 金币+4, MolEPI+1, Good！ 2012-04-24 18:40:58
引用回帖:
8楼: Originally posted by chlamy at 2012-04-19 20:35:14:
的却可能存在你说的这种情况，质粒没有完全切开，但是我的质粒全长13K，双酶切开后长12K，电泳回收时也很难跑开，回收就挺难了。
对于酶切体系，是这样的。我们取其中的少部分来做连接。通过电泳条带可以很明显 ...

载体确实不小，
1.通过电泳都可以看出一个酶切开了，就代表还是可以通过跑胶将全长及酶切后的产物分开的，况且超螺旋会小很多，做个长胶，多跑会。
2.通过生长出来的菌落判断连接效率没有道理。
3.双酶切可以分步进行，不一定要在同一种buffer中同时加两个酶，这样会提高效率。
4.防止载体自连可以去磷酸化。
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生活是面镜子~
14楼2012-04-20 13:11:18
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seahow

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:12
最好回收，否则假阳性很多的； 另外可以加上其他的酶使出现多个片段，无法重新连接。
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2楼2012-04-19 17:28:35
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:30
小丹木木: 金币+3, good 2012-04-20 13:42:37
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？此体系中混有酶切buffer，怎么能顺利进行连接反应？
3.基于以上原因，即使挑10000个菌也是一样的结果。
4.楼主可以尝试大分量的回收试剂盒来解决大质粒的回收问题。
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生活是面镜子~
3楼2012-04-19 18:13:50
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:13:50:
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？ ...

就是说酶切好了，要回收后再连接，不能直接连吗？如果检测酶切完全，应该可以直接用吧？
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4楼2012-04-19 18:59:50
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