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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶切后未纯化连接出现的问题
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chlamy

木虫 (小有名气)

[求助] 酶切后未纯化连接出现的问题

各位路过的虫友：

最近在做酶切连接的实验，由于质粒太大，回收效果太差，有时就酶切后直接连接，连接载体和片段的比例为1：10，挑了40个克隆检测，全为假阳性，又做了一次比例为1：100，挑了20个克隆，发现也全部为假阳性（就是质粒又重新连接了）。请问路过的各位做过这样实验的虫友，一般挑多少才会有我要的克隆呢？还是其他原因导致我的目的片段连接不上呢？
对于酶切的结果，已经电泳检测，基本上酶切完全；

在此谢过。
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1楼 2012-04-19 16:57:56
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chibang1220

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
chlamy: 金币+1 2012-04-19 21:00:15
西瓜: 金币+1, 鼓励交流 2012-04-24 18:41:27
引用回帖:
6楼: Originally posted by chlamy at 2012-04-19 20:21:18:
质粒切后长12K，用常规的时试剂盒回收时质量非常低，所以就直接酶切后连接了。为了防止其连接回去，所以加大目的片段的量（质粒：目的片段比例为1：100）。但是结果还是假阳性。

我明白了。我也做过大片段回收。主要是在回收时每一次换溶液后都静置2-3分钟，效果会稍微好点，而且切胶时能刻少一点也不要多余的胶，但不能太少啊，我只是说尽量少的切多余的胶。再有就是连接时比例很重要的，不是加的越多越好，一定控制好比例，我觉得这也是个错误的地方
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人的差别在于业余时间
7楼2012-04-19 20:33:22
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查看全部 19 个回答

seahow

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:12
最好回收，否则假阳性很多的； 另外可以加上其他的酶使出现多个片段，无法重新连接。
赞一下 回复此楼
2楼2012-04-19 17:28:35
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to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
chlamy: 金币+1, ★有帮助 2012-04-19 19:26:30
小丹木木: 金币+3, good 2012-04-20 13:42:37
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？此体系中混有酶切buffer，怎么能顺利进行连接反应？
3.基于以上原因，即使挑10000个菌也是一样的结果。
4.楼主可以尝试大分量的回收试剂盒来解决大质粒的回收问题。
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生活是面镜子~
3楼2012-04-19 18:13:50
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kabuqinuo89

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by to-be at 2012-04-19 18:13:50:
1.楼主的实验思路非常错误，绝对不可以酶切不回收直接连接。因为不能保证完全切开，肯定混有大量质粒，可以想象这样的混合物做转化后得到的克隆中几乎都是未切完全的质粒。
2.酶切体系很大的，怎么可以直接连接？ ...

就是说酶切好了，要回收后再连接，不能直接连吗？如果检测酶切完全，应该可以直接用吧？
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4楼2012-04-19 18:59:50
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