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wanghx_2012银虫 (小有名气)
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[求助]
载体和酶切片段连接的问题
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| 各位朋友,我现在在做重组质粒,用的是PHT304,想要在接头区连接一个Cry3a的启动子,现在我在启动子的上下油分别加了Pst1和Xba1的酶切位点.我用双酶切了T载体和304之后割胶回收了对应大小的片段,然后T4连接过夜转化DH5a,挑抗性平板上长的单菌落做PCR时可以看到微弱的1000bp的条带但是提质粒提出来的DNA远大于重组质粒理论大小.酶切的时候也看不到目标条带.我怀疑是不是有这样的情况:我的启动子自我连接了,然后这个连接体被接到了切开的304上.或则各位朋友有没有什么好的建议.多谢!~ |
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wanghx_2012
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【答案】应助回帖
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wanghx_2012: 金币+2, ★有帮助 2012-08-24 20:52:44
wanghx_2012: 金币+2, ★有帮助 2012-08-24 20:52:44
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1.PCR扩增有弱条带，但是酶切却没有，原因很可能是没有连接到304载体，因为菌落PCR有时候也会出现假阳性，我们可以简单理解为目的片段只是附着在菌落表面，所以PCR扩增是可以的，但是一旦摇成菌液再PCR检测，可能连弱带也没有了，楼主实在不放心，简单的方法是送去测序就知道有没有连接上了！ 2.质粒与预测大小不一致，质粒正常提取一般会有螺旋，环状等结构，质粒条带的位置变化和这些结构也有一定关系，不能完全说明什么问题！ 所以最简单的方法送去测序，一般一个反应也就25元左右，与酶切花费差不多。 |
4楼2012-08-24 16:25:34