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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
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serena08

新虫 (初入文坛)

[求助] 单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题

最近做的几个克隆都非常不顺，一个多月了，天天连接转化涂板，天天收的空白板  
一个涉及到多片段的连接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb
另一个是大片段单酶切连接（Pac I)：6.7kb+12kb

一直是怀疑连接的效率问题，单转质粒作为阳性对照确定感受态是好的。
具体：（1）多片段连接：确定多片段连接中的几个片段都是酶切彻底的，跑胶，切胶做回收，用的QIAGEN的胶回收试剂盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后浓度仅达20ng/ul。回收后片段做连接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速连接试剂盒也有试过，均按说明操作（普通连接酶：10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度；快速连接试剂盒：同上一样的体系，室温5分钟），均未有单菌落生长。
（2）大片段连接：6.7kb的insert质粒和12kb载体质粒均用PacI进行酶切，酶切后跑胶回收，载体片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也仅十几ng/ul，同样的用NEB的T4 DNA ligase做连接，10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度，未见有单克隆生长。
这段时间全耗在连接转化上面了，严重打击了我科研的信心

想求助一下大家在多片段的连接或大片段的连接转化中都需要注意哪方面的问题呢？有大牛帮忙分析分析失败的原因吗？
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1楼2012-12-06 14:34:47
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回帖置顶 ( 共有1个 )

gyesang

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【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 回帖置顶 2012-12-06 20:08:34
amisking: 金币+5, MolEPI+1, 鼓励 2012-12-06 20:08:42
楼主的第一个克隆难度的确是蛮大的，第二个还好，
1. 根据你的描述，总是空板，你有没有测试过你转化时用的感受态的效率，因为你是多片段和大片段连接，对感受态效率还是有一定要求的，最好用那种超级感受态细胞转化比较好，因此，你首先测试下你的感受态细胞，同时用个阳性质粒测试你的平板的抗性，你天天收白板，也可能是你用错抗性平板了

2. 对于第一个多片段克隆，片段是不是太多了点，而且你是PCR产物直接酶切，你可以先把片段连上T-载体等中间载体，然后再酶切回收回来，这样保证每一个片段都被充分酶切开，然后再多片段连试试

3.对于第一个多片段连接，楼主是不是也可考虑用Overlap PCR的方法，先把四个片段拼接为一个片段再往载体上连

4. 你大片段连接的过程和体系都是没有问题的，但是你总是连接不上，会不会是所用连接酶有问题？

5. 不知道楼主大片段连接是，载体单酶切后有没有进行去磷酸化，如果没有的话，连接后，板子上应该会长很多克隆才对，这是载体自连导致的，是板子的问题还是感受态的问题，楼主可以排查一下

[ Last edited by gyesang on 2012-12-19 at 23:57 ]
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2楼2012-12-06 18:19:42
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普通回帖

serena08

新虫 (初入文坛)
首先非常感谢gyesang的热心回帖！一早我就上来看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的问题，我一一做个排查：
1. 做过单转质粒的阳性对照，虽然没有每次都有这个阳性对照，但开始的时候是确定过抗性是对的，转质粒效率是没有太大问题的，至于是不是超级感受态我真不敢肯定，用的是全式金的Trans-T1；
2. 对于第一个多片段，四个片段均不是PCR后直接酶切，都是从质粒上酶切下来的...... 其中，前两个700bp左右的是insert，最初也是PCR酶切，但后来也是为了排除PCR酶切可能不完全，所以又先构到T载体中做了酶切回收，而后两个3.6+1.6kb的片段是载体片段中切下来的，所以能确定待连接的片段酶切是完全的；
3. overlap PCR的方法没做过，不知道是否可行，实现起来难度有多大？
4. 连接酶是NEB的T4，之前订的都被我用完了，所以最近做的这几次是用的新订的一支，可以考虑做个常规的连接排查一下连接酶的问题，先准备订个fermentas的连接酶试试；
5. 您这个问题真是问到我心里去了，这个问题也非常困扰我，载体单酶切后并没有做去磷酸化处理，为何连自连的都没有能？？板子和感受态都有空转质粒载体的对照，确定没问题。那么就是连接酶了。。。

另外，有推荐使用的超级感受态细胞吗？国外品牌的没法进口，但国内的不清楚哪家的感受态做得最好？以前都是做的常规克隆，所以也没遇到过这么多问题，请大家多交流指教了！
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3楼2012-12-07 08:23:25
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gyesang

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
引用回帖:
3楼: Originally posted by serena08 at 2012-12-07 08:23:25
首先非常感谢gyesang的热心回帖！一早我就上来看是否有回帖，很欣喜，今天心情比昨天要好多了。下面就您的问题，我一一做个排查：
1. 做过单转质粒的阳性对照，虽然没有每次都有这个阳性对照，但开始的时候是确定过 ...

1. 关于你的第一个克隆，我强烈建议你先用Overlap PCR的方法把片段连好，再往载体上构建，从时间上， 比你在那撞运气式的四片段连接肯定会快很多，主要缺点就是需要合成引物，浪费钱，但为了实验，我们不在乎这点钱

2. 载体单酶切后并没有做去磷酸化处理，且没有自连，而且你的板子和感受态也验证没有问题，那你需要考虑换连接酶了，这里给你个推荐（绝对非广告，因为我们实验室一直用，就是觉的还可以），你可以去查查toyobo公司的ligation high这个连接酶

3. 关于感受态，我没有什么建议的，我们都是实验室自己做的感受态，专门人负责的，可能是经常做的缘故吧，都到了如火纯清的地步了，感受态基本没出现过问题，且好用，至于哪个公司卖，还真不清楚
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4楼2012-12-08 21:32:10
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zd0017

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

不知楼主是否还在，我最近也在做一个多片段的连接问题，一直连不上，求指教！！！
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5楼2013-05-12 10:13:07
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Haibara_Ai

铜虫 (小有名气)
首先不做去磷酸化，就算连出来是你目标片段概率估计连1/1000都没有

之后你如果想提高浓度得话可以蒸发下你回收的DNA，或者用zymo的那种可以用6ul水洗脱的柱子
不过我觉得你应该是其他步骤有问题，10ng/ul的载体自连肯定能连出来。当然pacI我没用过，效率有点差别也有可能。另外12KB以上建议还是电转化，heatshock效率随着长度上升线性下降。
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6楼2013-05-12 21:41:44
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whs1230

新虫 (初入文坛)
楼主后来怎么做的？为什么没有消息了？
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7楼2013-10-30 19:21:12
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gyesang

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引用回帖:
7楼: Originally posted by whs1230 at 2013-10-30 19:21:12
楼主后来怎么做的？为什么没有消息了？

楼主最后做出来了，我们私下交流的
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8楼2013-10-30 22:48:30
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9楼2013-10-31 08:57:22
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