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hnksc

铁虫 (初入文坛)

[交流] 单酶切连接......急 已有6人参与

最近做单酶切连接老是连不上,我的载体10000,目的片段3000,酶切位点是ECOR1,载体用CIAP做过处理,16度连接24h,转化后没有单菌落生长,做过N次了结果都一样。
连接体系是摩尔比载体:目的片段=1:3

载体浓度是110ng/微升,目的是30ng/微升,用紫外分光光度计测的。这个浓度低吗?感受态应该没问题的,我做过测试的

[ Last edited by 1949stone on 2011-8-2 at 16:25 ]
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hnksc

铁虫 (初入文坛)

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-02 16:11:12
连接体系是摩尔比载体:目的片段=1:3,
2楼2011-08-02 11:58:29
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 2011-08-02 16:11:24
是不是载体浓度太低了?你最后在处理完后跑胶看看浓度,还有片段的浓度也确认下,如果这两个都没问题,看抗性有没有弄错了,最后也可能是感受态效率太低的缘故
在等待中涅槃重生
3楼2011-08-02 11:58:32
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hnksc

铁虫 (初入文坛)

载体浓度是110ng/微升,目的是30ng/微升,用紫外分光光度计测的。这个浓度低吗?感受态应该没问题的,我做过测试的。
4楼2011-08-02 12:14:55
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-03 19:35:57
你的目的基因浓度比载体还低,所以目的基因应该多加一些,10ul体系中载体加2.5ul 基因加6ul,然后再进行连接。。。。
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-08-02 13:37:21
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hnksc

铁虫 (初入文坛)


西瓜(金币+1): 鼓励新虫交流 2011-09-04 18:46:28
你说的这个质量比,不是要求的是摩尔比吗?我的1:3是摩尔比呀
6楼2011-08-02 14:04:58
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yuxia82012

木虫 (著名写手)

建议你不要拿那个测,上个1-2uL直接跑个胶看看能不能看到,还有载体抗性确定没弄错?
在等待中涅槃重生
7楼2011-08-02 16:15:21
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hnksc

铁虫 (初入文坛)

抗性没弄错,我肯定。跑胶我也做过,目测浓度,也没有菌生长。
8楼2011-08-02 16:22:42
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longage.gene

银虫 (小有名气)

★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-03 19:36:08
CIAP后作了什么处理?直接和目的片断连?有没有在CIAP后失活或提纯?建议过柱提纯。请告诉现在进展,成功与否
9楼2011-08-02 19:56:49
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longage.gene

银虫 (小有名气)


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还有目的片断如何由来?请说明。
10楼2011-08-02 19:58:59
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