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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～

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[交流] 【求助/交流】单酶切连接的克隆急…… 已有9人参与

最近做得克隆是单酶切连接的，各种连接体系都试过了就是连不上，各位高手给点意见，如何提高单酶切的连接率，我的酶切位点是EcoR1.

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【求助/交流】为什么pUC18和DNA片段经过Eco1和Hind3酶切后无法连接已经有3人回复

平和悦衲！

1楼 2010-05-19 16:01:27

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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)

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lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 16:48:39

最好是降载体去磷酸化以后再做连接。

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2楼2010-05-19 16:05:54

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xuwei1759

金虫 (小有名气)

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将载体先去磷酸化，然后再连接试一试。

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纵然春去落花笑，待到秋实何人傲？

3楼2010-05-19 16:06:16

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liyong1981

金虫 (正式写手)

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同意楼上二位～

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4楼2010-05-19 16:17:15

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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲

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lstt09nk(金币+3):热心虫友~~ 2010-05-19 21:22:00

烦请楼主把自己做的实验讲的清楚一些：影响因素太多了。
1、末端去磷酸化是一种方法，去磷酸化麻烦不少。
2、用的是T4 ligase吗？16℃＞１０ｈ连接吗？，也可以４℃链接两天。
3、插入片段与载体的比例，按照摩尔数控制好，再就是片段大小，与载体的相对大小也需要考虑。
4、链接反应缓冲液是否ok？
5、是否需要考虑连接方向问题？
6、特别要考虑的是甲基化的影响，分析序列中的可能甲基化的位点，看看酶是否受其影响。也可选择不受其影响的酶，fermentus的是不错的。

祝好运！

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5楼2010-05-19 17:41:35

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