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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】单酶切连接的克隆急……
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～

[交流] 【求助/交流】单酶切连接的克隆急…… 已有9人参与

最近做得克隆是单酶切连接的，各种连接体系都试过了就是连不上，各位高手给点意见，如何提高单酶切的连接率，我的酶切位点是EcoR1.
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平和悦衲！
1楼 2010-05-19 16:01:27
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dfl204

铁杆木虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+1):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 16:48:39
最好是降载体去磷酸化以后再做连接。
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2楼2010-05-19 16:05:54
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xuwei1759

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
将载体先去磷酸化，然后再连接试一试。
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纵然春去落花笑，待到秋实何人傲？
3楼2010-05-19 16:06:16
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liyong1981

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
同意楼上二位～
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4楼2010-05-19 16:17:15
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zhwenxing

木虫 (著名写手)

尛森蟲
★ ★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+3):热心虫友~~ 2010-05-19 21:22:00
烦请楼主把自己做的实验讲的清楚一些：影响因素太多了。
1、末端去磷酸化是一种方法，去磷酸化麻烦不少。
2、用的是T4 ligase吗？16℃＞１０ｈ连接吗？，也可以４℃链接两天。
3、插入片段与载体的比例，按照摩尔数控制好，再就是片段大小，与载体的相对大小也需要考虑。
4、链接反应缓冲液是否ok？
5、是否需要考虑连接方向问题？
6、特别要考虑的是甲基化的影响，分析序列中的可能甲基化的位点，看看酶是否受其影响。也可选择不受其影响的酶，fermentus的是不错的。

祝好运！
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5楼2010-05-19 17:41:35
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
lstt09nk(金币+2):欢迎多多交流~~ 2010-05-19 21:22:18
1.单酶切一定要去磷酸化，否则基本上会是载体自连的；
载体单酶切之后一定要去磷酸化，而且磷酸化不彻底也基本上是载体自连；
所以单酶切去磷酸化一定要完全；
2.磷酸化是载体量要少，反应半小时后还要补加CIAP
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
6楼2010-05-19 21:08:08
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
又做了一个去磷的，但回收后载体量非常少，核酸电泳都看不见，能连吗？
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平和悦衲！
7楼2010-05-20 09:18:49
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jasco

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by haoqian6135 at 2010-05-20 09:18:49:
又做了一个去磷的，但回收后载体量非常少，核酸电泳都看不见，能连吗？

再少也要试试看，除非你的外源片段很珍贵
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8楼2010-05-20 09:45:00
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boystrong

银虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
单酶切这个我最大做过6300bp的链接，巧合的是也是ECORI，但是我的载体做了特殊的处理，前期一连就上，但是菌保存在-70℃2个月发现目的片段会自动退出来。我个人认为主要还是在载体的选择
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梦想追风
9楼2010-05-20 12:07:37
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hnksc

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
你的连接体系是按摩尔比连的吗？一定要是摩尔比
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10楼2011-08-02 11:30:16
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