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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 单酶切连接......急
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hnksc

铁虫 (初入文坛)

[交流] 单酶切连接......急 已有6人参与

最近做单酶切连接老是连不上，我的载体10000，目的片段3000，酶切位点是ECOR1，载体用CIAP做过处理，16度连接24h，转化后没有单菌落生长，做过N次了结果都一样。
连接体系是摩尔比载体：目的片段=1:3

载体浓度是110ng/微升，目的是30ng/微升，用紫外分光光度计测的。这个浓度低吗？感受态应该没问题的，我做过测试的

[ Last edited by 1949stone on 2011-8-2 at 16:25 ]
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1楼 2011-08-02 11:47:10
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hnksc

铁虫 (初入文坛)
★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-02 16:11:12
连接体系是摩尔比载体：目的片段=1:3，
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2楼2011-08-02 11:58:29
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
★ ★ ★
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dhd997(金币+2): 2011-08-02 16:11:24
是不是载体浓度太低了？你最后在处理完后跑胶看看浓度，还有片段的浓度也确认下，如果这两个都没问题，看抗性有没有弄错了，最后也可能是感受态效率太低的缘故
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在等待中涅槃重生
3楼2011-08-02 11:58:32
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hnksc

铁虫 (初入文坛)
载体浓度是110ng/微升，目的是30ng/微升，用紫外分光光度计测的。这个浓度低吗？感受态应该没问题的，我做过测试的。
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4楼2011-08-02 12:14:55
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-03 19:35:57
你的目的基因浓度比载体还低，所以目的基因应该多加一些，10ul体系中载体加2.5ul 基因加6ul，然后再进行连接。。。。
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
5楼2011-08-02 13:37:21
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hnksc

铁虫 (初入文坛)
★
西瓜(金币+1): 鼓励新虫交流 2011-09-04 18:46:28
你说的这个质量比，不是要求的是摩尔比吗？我的1:3是摩尔比呀
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6楼2011-08-02 14:04:58
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yuxia82012

木虫 (著名写手)
建议你不要拿那个测，上个1-2uL直接跑个胶看看能不能看到，还有载体抗性确定没弄错？
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在等待中涅槃重生
7楼2011-08-02 16:15:21
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hnksc

铁虫 (初入文坛)
抗性没弄错，我肯定。跑胶我也做过，目测浓度，也没有菌生长。
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8楼2011-08-02 16:22:42
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longage.gene

银虫 (小有名气)
★ ★
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1949stone(金币+1): 鼓励 2011-08-03 19:36:08
CIAP后作了什么处理？直接和目的片断连？有没有在CIAP后失活或提纯？建议过柱提纯。请告诉现在进展，成功与否
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9楼2011-08-02 19:56:49
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longage.gene

银虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
还有目的片断如何由来？请说明。
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10楼2011-08-02 19:58:59
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