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单酶切的大片段连接转化及多个片段的连接转化问题
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最近做的几个克隆都非常不顺，一个多月了，天天连接转化涂板，天天收的空白板 一个涉及到多片段的连接：700bp+800bp+1.6kb+3.6kb 另一个是大片段单酶切连接（Pac I)：6.7kb+12kb 一直是怀疑连接的效率问题，单转质粒作为阳性对照确定感受态是好的。 具体：（1）多片段连接：确定多片段连接中的几个片段都是酶切彻底的，跑胶，切胶做回收，用的QIAGEN的胶回收试剂盒，但回收率一般，小片段（<1kb)回收后浓度仅达20ng/ul。回收后片段做连接，用的是NEB的T4 DNA ligase，他家的快速连接试剂盒也有试过，均按说明操作（普通连接酶：10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度；快速连接试剂盒：同上一样的体系，室温5分钟），均未有单菌落生长。 （2）大片段连接：6.7kb的insert质粒和12kb载体质粒均用PacI进行酶切，酶切后跑胶回收，载体片段回收效率很低，不到10ng/ul，insert片段也仅十几ng/ul，同样的用NEB的T4 DNA ligase做连接，10ul体系，1ul buffer，0.5ul的酶，其余的均是DNA，室温过夜后转16度，未见有单克隆生长。 这段时间全耗在连接转化上面了，严重打击了我科研的信心  想求助一下大家在多片段的连接或大片段的连接转化中都需要注意哪方面的问题呢？有大牛帮忙分析分析失败的原因吗？ |
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 【分子生物】EPI帖 |
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6楼2013-05-12 21:41:44