应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段连接问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
211/3返回列表123下一页
查看: 3368  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

[求助] 大片段连接问题

实验室得到一个片段为2300bp左右的DNA序列，但是连接了半个月都没有连上，连接体系是：19T 0.5ul
            目的条带 5ul
           solution I  5ul
       过夜4度，16度连接3h
   也做过16度连接两夜
    做过4度
  期间确定目的条带回收正确，连接体系也用了最新的，感受态是买的，在这个条带的靠近3‘端约200bp是已知的，根据这个片段设计引物，扩增约为140bp。
  得到的结果：1.不长菌
              2.长菌，但是扩增无条带
              3.长菌，扩增出140bp,但是测序后，结果告知插入片段只有200bp,且这200bp片段就是已知部分，抽了质粒后得知条带大约就是比2000bp的大点。

我快疯了，折腾了半个月，序列还没得到，求高人指导！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-14 20:04:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
本帖内容被屏蔽
3楼2012-04-15 09:46:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)
引用回帖:
11楼: Originally posted by xiazhiwuxie at 2012-04-16 12:08:21:
主要是我的实验，上游是试剂盒的接头，下游是我设计的引物，一般把片段送出去，要提供一对引物的。我只能提供下游引物

片段测序可以只提供一个引物，单向进行测序，有下游引物就够了
赞一下(1人) 回复此楼
16楼2012-04-16 19:16:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

dingfang0707

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, 已经调整了，但是2000多的，目的条带都和载体差不多大了 2012-04-15 10:13:54
把连接所加的试剂跟DNA的比例调整一下就行了
赞一下 回复此楼
开心过好每一天
2楼2012-04-14 20:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
1.连接体系为10uL，目的DNA片段应为4.5uL,一般试剂盒都可用，连接温度是不关键因素，时间过夜即可。
2.一定要保证PCR要达到一定浓度和纯度才可以，这一点至关重要。
3.另外，楼主说的300bp引物是菌液PCR检测引物吗？最好用一个载体引物，一个片段上的引物，假阳性会降低，而且最好把全长扩出来。
4.若果菌液ＰＣＲ扩出来了就不用提质粒了酶切了，可以直接测序。
赞一下 回复此楼
生活是面镜子~
4楼2012-04-15 12:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwq652

木虫 (正式写手)
连接过夜，我们一般连接十分钟到半个小时，2k的很容易连啊，我们做五六k的都在连啊
赞一下 回复此楼
一念错，便觉百行皆非，防之当如渡海浮囊，勿容一针之罅漏
5楼2012-04-15 16:56:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 专家考核 2012-04-16 13:55:31
酶切连接不光看你的条带有多大，而是看你的载体和目的片段的相对浓度。。。设计好一个连接体系。。。然后就是转化的问题了。。。
当然，个人认为还是连接这一步比较重要。。。尤其是你上一步的酶切纯化是否干净，如果不干净，那么直接影响后期的连接。。。。
赞一下 回复此楼
Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
6楼2012-04-15 21:41:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

coh2lxx

银虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by lwq652 at 2012-04-15 16:56:45:
连接过夜，我们一般连接十分钟到半个小时，2k的很容易连啊，我们做五六k的都在连啊

请问你们是怎么做的啊。我最近也在做，总是不理想。能否给些具体的方法。非常感谢！！
赞一下 回复此楼
7楼2012-04-15 23:25:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你的意思，你想要片段的序列？那就直接把片段送去测序好了，引物从你已知的部分设计。等测序结果出来了，一切就好办了。其实，T载的连接效率并不是固定的，有时候同样大的片段，有的很好连接，有的就很难连接。
赞一下 回复此楼
8楼2012-04-16 09:13:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lwq652

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 看来你们的酶不错呀~ 2012-04-16 21:35:44
其实2k不算什么大片段的，我们单个基因就有2k多，几个基因下来更长。我们一般的体系是10ul，酶0.5，buffer 1，基因加载体8.5，至于两者比例要看电泳条带，但载体不超过3ul。连接十分钟到半个小时（说明书是十分钟，但我们一般会延长一点，除非时间来不及）立马做转化（10ul/100ul）。
赞一下 回复此楼
一念错，便觉百行皆非，防之当如渡海浮囊，勿容一针之罅漏
9楼2012-04-16 10:27:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

YZQ_XM

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西瓜: 金币+2, 鼓励新虫积极交流！ 2012-04-16 21:35:55
首先是设计好体系，然后可以试试其他连接酶，T4还是不错的。
赞一下 回复此楼
10楼2012-04-16 10:51:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 xiazhiwuxie 的主题更新
211/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 285求调剂 +12 哦呦呼o 2026-04-04 12/600 2026-04-06 23:04 by chenzhimin
[考研] 305求调剂 +3 77Qi 2026-04-06 3/150 2026-04-06 15:36 by going home
[考研] 一志愿河北工业大学材料工程，初试344求专硕调剂 +6 15933906766 2026-04-05 6/300 2026-04-06 13:21 by 无际的草原
[考研] 材料专硕283求调剂 +17 试试看呗 2026-04-04 18/900 2026-04-06 09:24 by 286640313
[考研] 086000生物与医药求调剂 +3 老天眷顾之人 2026-03-31 3/150 2026-04-05 22:24 by syh9288
[考研] 328分调剂 +6 门men 2026-04-04 6/300 2026-04-05 13:40 by imissbao
[考研] 11408,335分，本科211，求调剂，可转专业 +5 鳄梨大鳄鱼 2026-04-03 5/250 2026-04-04 22:49 by chongya
[考研] 325求调剂 +4 春风不借意 2026-04-04 4/200 2026-04-04 22:08 by 啵啵啵0119
[考研] 0835学硕299求调剂 08大类可接受 +5 useryy 2026-04-03 5/250 2026-04-04 20:07 by 蓝云思雨
[考研] 302求调剂一志愿华中师范大学 +8 小江小江江江 2026-04-02 8/400 2026-04-04 19:50 by 蓝云思雨
[考研] [调剂信息]085408光电信息 求调剂 总分291分数一英一 +3 iz11az 2026-04-02 3/150 2026-04-04 19:09 by 蓝云思雨
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +5 崔wj 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:06 by arrow8852
[基金申请] 请问共同通讯和共同一作的认可度问题 10+4 psa1234 2026-04-01 10/500 2026-04-03 11:08 by Kittylucky
[考研] 372分材料与化工（085600）一志愿湖南大学求调剂 +5 蓝笺片 2026-04-02 6/300 2026-04-02 21:37 by dongzh2009
[考研] 0856材料与化工调剂，339 +14 10213207 2026-03-31 14/700 2026-04-02 21:01 by 1104338198
[考研] 318求调剂 +3 笃行致远. 2026-03-31 4/200 2026-04-02 15:56 by Jaylen.
[考研] 270调剂 +7 maxjxbsk 2026-04-02 7/350 2026-04-02 09:50 by yulian1987
[考研] 08工科275求调剂，可跨考。 +5 AaAa7420 2026-03-31 5/250 2026-04-01 15:21 by 159357hjz
[考研] 环境工程调剂 +9 hyzzzzzzz. 2026-04-01 9/450 2026-04-01 14:20 by salamander`
[考研] 262求调剂 +9 励志一定发文章 2026-03-31 10/500 2026-04-01 12:22 by sunshine0013
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭