应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大片段连接问题
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 3383  |  回复: 20
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

xiazhiwuxie

银虫 (小有名气)

[求助] 大片段连接问题

实验室得到一个片段为2300bp左右的DNA序列，但是连接了半个月都没有连上，连接体系是：19T 0.5ul
            目的条带 5ul
           solution I  5ul
       过夜4度，16度连接3h
   也做过16度连接两夜
    做过4度
  期间确定目的条带回收正确，连接体系也用了最新的，感受态是买的，在这个条带的靠近3‘端约200bp是已知的，根据这个片段设计引物，扩增约为140bp。
  得到的结果：1.不长菌
              2.长菌，但是扩增无条带
              3.长菌，扩增出140bp,但是测序后，结果告知插入片段只有200bp,且这200bp片段就是已知部分，抽了质粒后得知条带大约就是比2000bp的大点。

我快疯了，折腾了半个月，序列还没得到，求高人指导！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

分子生化实验经验积累

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-04-14 20:04:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yyy_zzz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看你的意思，你想要片段的序列？那就直接把片段送去测序好了，引物从你已知的部分设计。等测序结果出来了，一切就好办了。其实，T载的连接效率并不是固定的，有时候同样大的片段，有的很好连接，有的就很难连接。
赞一下 回复此楼
8楼2012-04-16 09:13:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答

dingfang0707

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, 已经调整了，但是2000多的，目的条带都和载体差不多大了 2012-04-15 10:13:54
把连接所加的试剂跟DNA的比例调整一下就行了
赞一下 回复此楼
开心过好每一天
2楼2012-04-14 20:20:10
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ghs25372216

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+5, ★有帮助, 我昨天想用T4连接酶连着，但是实验室没人做过，今天试试 2012-04-15 10:12:57
小丹木木: 金币+3, 恩，可以试下 2012-04-16 13:54:47
本帖内容被屏蔽
3楼2012-04-15 09:46:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

to-be

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
xiazhiwuxie: 金币+2, ★有帮助, PCR回收后条带清晰 2012-04-16 12:12:16
小丹木木: 金币+3, 鼓励正解解答问题 2012-04-16 13:55:10
1.连接体系为10uL，目的DNA片段应为4.5uL,一般试剂盒都可用，连接温度是不关键因素，时间过夜即可。
2.一定要保证PCR要达到一定浓度和纯度才可以，这一点至关重要。
3.另外，楼主说的300bp引物是菌液PCR检测引物吗？最好用一个载体引物，一个片段上的引物，假阳性会降低，而且最好把全长扩出来。
4.若果菌液ＰＣＲ扩出来了就不用提质粒了酶切了，可以直接测序。
赞一下 回复此楼
生活是面镜子~
4楼2012-04-15 12:16:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 21 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 调剂 +16 不逢春 2026-04-07 17/850 2026-04-08 00:22 by T可可西里T
[考研] 材料与化工专硕306分找合适调剂 +20 沧海轻舟e 2026-04-06 20/1000 2026-04-07 22:54 by 来看流星雨10
[考研] 0854电子信息319求调剂（接受跨专业调剂） +5 星星不眨眼喽 2026-04-05 6/300 2026-04-07 22:16 by hemengdong
[考研] 336材料与化工085600求调剂 +19 水星记infp 2026-04-05 22/1100 2026-04-07 21:11 by yongzhesheng
[考研] 287求调剂 +3 通信学硕081000 2026-04-03 4/200 2026-04-06 21:03 by going home
[考研] 285求调剂 +5 mapmath 2026-04-06 6/300 2026-04-06 17:18 by 蓝云思雨
[考研] 0857大类环境工程B区求调剂 +3 龚禹铭 2026-04-05 3/150 2026-04-06 10:22 by 蓝云思雨
[考研] 求调剂 +5 wos666 2026-04-03 5/250 2026-04-06 10:13 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿C9的化学工程（085602） 340分，感觉校内调剂无望，求调剂 +12 万事宜臻 2026-04-04 12/600 2026-04-06 07:46 by 无际的草原
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358求调剂 +6 cs0106 2026-04-05 6/300 2026-04-05 16:34 by imissbao
[考研] 288求调剂，一志愿华南理工大学071005 +6 ioodiiij 2026-04-04 6/300 2026-04-05 10:09 by guoweigw
[考研] 求生物学学硕调剂——364分 +7 云朵遛弯指南 2026-04-04 7/350 2026-04-04 22:49 by zhyzzh
[考研] 333求调剂 +12 wfh030413@ 2026-04-03 13/650 2026-04-04 21:02 by jj987
[考研] 一志愿重庆大学085404，总分314分，求调剂 +4 zf83hn 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:25 by 啵啵啵0119
[考研] 295求调剂 +3 尚偌呀 2026-04-03 4/200 2026-04-03 21:23 by zhq0425
[考研] 336求调剂 +8 kiyy 2026-04-01 8/400 2026-04-03 19:41 by lijunpoly
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +5 崔wj 2026-04-03 5/250 2026-04-03 15:06 by arrow8852
[考研] 289-求调剂 +4 这里是_ 2026-04-03 4/200 2026-04-03 14:23 by 1753564080
[考研] 266分，一志愿电气工程，本科材料，求材料专业调剂 +9 哇呼哼呼哼 2026-04-02 9/450 2026-04-03 12:05 by 1753564080
[考研] 一志愿山东大学，085600，344 +7 魏子per 2026-04-02 8/400 2026-04-02 21:12 by 百灵童888
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭