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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 综合其他 » 【求助/交流】4kb片段的连接
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】4kb片段的连接已有7人参与

4kb大小的dna片段，我已经连接了3个月了，pMD-18T和其他的表达载体我都连接过，刚开始以为pcr产物浓度不够高，后来我加大pcr的量，还是连接不上，有时候一次提取30个质粒都是假阳性，请问高手怎样才能使4kb的片段连上啊？
在这样下去我快疯了！
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1楼2010-07-30 12:44:24
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sl19840203

木虫 (小有名气)
★
看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:02
你是单酶切还是双酶切啊，单酶切注意去磷酸化
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2楼2010-07-30 12:58:02
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by sl19840203 at 2010-07-30 12:58:02:
你是单酶切还是双酶切啊，单酶切注意去磷酸化

我是双酶切，ECORI含3个保护碱基，SalI含5个保护碱基。
我一直以为是pcr产物酶切不完全，但是为何连t载体也连不上啊！
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3楼2010-07-30 13:25:28
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)
★
看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:13
如果你的PCR产物是TAQ酶扩增在pMD-18T上可以不同酶切直接连接。
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4楼2010-07-30 13:36:29
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-07-30 13:36:29:
如果你的PCR产物是TAQ酶扩增在pMD-18T上可以不同酶切直接连接。

这个我知道，有没有那位高手连接过大片段，能不能告诉我注意那些？
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5楼2010-07-30 13:41:36
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

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优秀版主
★
看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:28
这么大，必定有突变……

比例你没注意吧，有时候是连接酶效率问题

建议换一个全式金的快速连接T载体
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6楼2010-07-30 13:54:07
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zemin_fang

木虫 (正式写手)
xucan0901(金币+1): 2010-07-30 14:32:56
我曾经用T载体连接了10kB的片段
在连接时首先你要确定你用的TAQ酶可以在片段末端加A，另外你的T载体上T没有掉，因为载体上掉T是很常见的情况，所以你要进行对照试验
连接时，确保连接比例在1:3到1:10之间，连接时间稍微延长到5小时左右，便可以连上，我是这样做的
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7楼2010-07-30 14:00:55
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-07-30 13:54:07:
这么大，必定有突变……

比例你没注意吧，有时候是连接酶效率问题

建议换一个全式金的快速连接T载体

silicare说的可是需要用感受态T1的载体？它只能连接3k以内的片段，需要20分钟左右。4kb的片段连不上。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
8楼2010-07-30 14:40:48
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by xucan0901 at 2010-07-30 12:44:24:
4kb大小的dna片段，我已经连接了3个月了，pMD-18T和其他的表达载体我都连接过，刚开始以为pcr产物浓度不够高，后来我加大pcr的量，还是连接不上，有时候一次提取30个质粒都是假阳性，请问高手怎样才能使4kb的片段 ...

我用LA Taq扩的6kb多片段可以连接到T载体（TAKARA，pMD-20）。但同步做的5k和4k的片段没连上，当然也有4k的片段已经成功了。与lz一样，转化后菌落PCR总是假阳性。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
9楼2010-07-30 14:42:45
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-30 14:42:45:

我用LA Taq扩的6kb多片段可以连接到T载体（TAKARA，pMD-20）。但同步做的5k和4k的片段没连上，当然也有4k的片段已经成功了。与lz一样，转化后菌落PCR总是假阳性。

你的意思是说，大片段的连接只是概率和运气的问题了吗？
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10楼2010-07-30 14:46:08
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