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ybs007

金虫 (小有名气)

[求助] 双酶切的片段不见了？

向大家请教一个问题，我最近在做转化，用的是pET-30a，连的片段为400bp，酶切位点为kpnI和HindIII，但是双酶切后，却没找到400的片段。之后我又分别做了单酶切，对照验证两个酶都有效的切开了质粒，但是就是没有400bp的目的片段，很纠结，很纠结，望各位虫友搭救！！！（PS：我用载体通用引物扩增的时候能扩出来720的片段，说明目的片段应该连上了）
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平生我自知
1楼 2011-08-26 19:22:25
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lxj341401

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
amisking(金币+1): 鼓励应助 2011-08-26 20:02:29
ybs007(金币+2): 嗯 我的师哥建议我用中提试试 2011-08-27 09:38:09
量少的话确实看不到小片段的，毕竟400片段只有大片段（5K）的十几分之一呀。
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2楼2011-08-26 19:47:53
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和一

银虫 (著名写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): 3Q 2011-08-30 08:03:54
我曾经也出现过这个问题，用的是PET28A，连接的片段是402bp，双酶切后402bp的片段看不见，后来用碱裂解法重提质粒，结果切出来了。分析原因，可能是用小提试剂盒提出的质粒量比较少，连接的片段又小，电泳上显示不出来。碱裂解法提出的质粒量比较大，楼主不妨试试。
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3楼2011-08-27 11:25:37
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lingbi

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 08:04:02
ybs007(金币+1): 2011-09-03 11:33:34
也许这两个酶不太好切，或者其中一管污染。先用第一个酶单切5小时，直接回收后再用第二个酶及其高效buffer 温度切2小时，电泳再看
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4楼2011-08-29 21:18:16
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瓶儿花

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): good 2011-08-30 18:46:12
ybs007(金币+1): 2011-09-03 11:33:50
加大酶切反应体系试试看，这样质粒浓度高，切出来小片段浓度也就高了。
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5楼2011-08-30 13:28:51
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jushi0619

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-08-30 18:46:20
ybs007(金币+1): 2011-09-03 11:34:40
你的片段小，染料量少的话可能显示的条带很淡  看不见很正常
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6楼2011-08-30 14:58:43
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-08-30 17:12:00
ybs007(金币+5): 感激不尽 2011-08-31 10:18:26
其实照楼主所说已经得到了重组载体，而且你基本已经确定正确了，就是需要一张perfect的酶切图把？
其实照你所说的，因为你的载体上连接的片段是400bp，相对较小一些，你的载体大小5.4kb,是基因的将近14倍，酶切的话应该选择一个稍微大一点的体系，至少得20ul以上，而且你要确保你的重组载体量足够大，就是电泳显示比较亮，这样你酶切之后才会看到那条400bp比较小的条带。。。如果重组载体量很少，那么直接over，不用酶切了，肯定看不到的。。。
我原来也遇到过类似的问题，你可以参看我这篇帖子，相信你一看就知道该如何去做了！
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3357650

祝好运！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
7楼2011-08-30 15:35:10
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