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双酶切的片段不见了？
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| 向大家请教一个问题，我最近在做转化，用的是pET-30a，连的片段为400bp，酶切位点为kpnI和HindIII，但是双酶切后，却没找到400的片段。之后我又分别做了单酶切，对照验证两个酶都有效的切开了质粒，但是就是没有400bp的目的片段，很纠结，很纠结，望各位虫友搭救！！！（PS：我用载体通用引物扩增的时候能扩出来720的片段，说明目的片段应该连上了） |
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 【分子生物】EPI帖 |
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lxj341401
至尊木虫 (著名写手)
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【答案】应助回帖
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dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-08-30 17:12:00
ybs007(金币+5): 感激不尽 2011-08-31 10:18:26
dhd997(金币+5, MolEPI+1): 2011-08-30 17:12:00
ybs007(金币+5): 感激不尽 2011-08-31 10:18:26
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其实照楼主所说已经得到了重组载体，而且你基本已经确定正确了，就是需要一张perfect的酶切图把？ 其实照你所说的，因为你的载体上连接的片段是400bp，相对较小一些，你的载体大小5.4kb,是基因的将近14倍，酶切的话应该选择一个稍微大一点的体系，至少得20ul以上，而且你要确保你的重组载体量足够大，就是电泳显示比较亮，这样你酶切之后才会看到那条400bp比较小的条带。。。如果重组载体量很少，那么直接over，不用酶切了，肯定看不到的。。。 我原来也遇到过类似的问题，你可以参看我这篇帖子，相信你一看就知道该如何去做了！ http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=3357650 祝好运！ |
7楼2011-08-30 15:35:10