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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】大家酶切载体怎么切？一般切多久？
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Ella14

银虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】大家酶切载体怎么切？一般切多久？ 已有4人参与

大家酶切载体怎么切？一般切多久？最近挑克隆总是不见阳性的。做了载体对照，张得很好，1UG，1U的酶，切过夜。。。去磷。。。
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1楼 2010-10-11 22:05:07
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-12 08:34:47
我一般1U的载体，做20ul体系先加第一种酶切3~4h，取1ul跑胶检测酶切完全。如不完全继续切
然后将体系扩到40ul加第二种酶一般切两个小时后胶回收。
不做去磷酸化。
一般3kbp左右的载体取100ng做酶连，外源片段对载体摩尔比在3~6：1左右快速酶连1小时或一般的16°过夜
基本每次都能连上
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终于熬成木虫了……
2楼2010-10-12 03:21:22
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
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dhd997(金币+1):有道理，最近很活跃。 2010-10-12 08:35:05
酶切不是关键，无阳性克隆可能是你的链接步骤有问题，要控制好基因和载体的比例啊。
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3楼2010-10-12 08:22:29
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王会征

铁杆木虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不是很活跃，而是很无聊啊。实验没有开题，无事可做啊。
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4楼2010-10-12 08:39:01
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ben1147

木虫 (正式写手)
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-13 08:39:19
挑克隆没有阳性的话，要分你酶切之后是否切胶回收了
如果切胶回收了，那假阳性应该是载体自连引起的，可能是去磷酸化不完全

如果没有切胶回收，直接拿酶切体系纯化后做连接，那么没切开和自连都有可能导致假阳性。区分方法就是用酶切产物直接做转化，如果也长，就说明有剩余没切开的质粒，要延长酶切时间（如果已经切过夜，应该不是时间问题）、加大酶量，或者检查一下酶切体系离子浓度或者酶切温度是否有问题；如果不长，那就还是自连引起的

至于载体和片段比例，对于去磷酸化或者双酶切的载体来说，没必要十分严格。至少我基本上就不会去关心浓度比，只要载体和片段质量过关，并且有一定的量，理论上不会出问题
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5楼2010-10-12 12:39:36
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Ella14

银虫 (小有名气)
[quote]Originally posted by zjzz at 2010-10-12 03:21:22:
我一般1U的载体，做20ul体系先加第一种酶切3~4h，取1ul跑胶检测酶切完全。如不完全继续切
  弱问一下怎么判断是否切割完全呢？
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6楼2010-10-12 12:59:53
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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上
★
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引用回帖:
Originally posted by Ella14 at 2010-10-12 12:59:53:
[quote]Originally posted by zjzz at 2010-10-12 03:21:22:
我一般1U的载体，做20ul体系先加第一种酶切3~4h，取1ul跑胶检测酶切完全。如不完全继续切
  弱问一下怎么判断是否切割完全呢？

看胶图有几条带，我一般都是取质粒上的单酶切位点切的，所以是很清爽的一条带
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终于熬成木虫了……
7楼2010-10-13 02:00:10
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