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tian1203

银虫 (著名写手)


[交流] 【求助/交流】片段转进去,提质粒酶切发现载体小了,想不明白

1200的片段,转进4800的表达载体
阳性克隆检测非常亮且大小正确。提质粒酶切1200的片段也切了下来。

但是,用DL-5000检测发现载体比理论小了1000-2000bp。非常想不明白,
就是说4800的载体+1200的目的基因,单酶切后理论上应该6000,为啥我的片段看着不到5000??质粒断了??

可以确定不是空载体,550的片段以前也出现过这种情况
DL-5000没问题,因为同时跑了DL-2000。
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tian1203

银虫 (著名写手)


2楼2010-12-16 10:11:58
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tian1203

银虫 (著名写手)


手机拍的,质量不好。请教各位高手原因
3楼2010-12-16 10:13:10
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)



dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-16 12:57:44
tian1203(金币+2): 2010-12-16 14:20:36
tian1203(金币+1):菌长的不多,其它的菌也是如此 2010-12-16 15:02:34
可以多挑几个阳性克隆,看看是不是都是这个情况
也可以尝试其他酶的双酶切,以至于3酶切,可以粗略估计哪一段缺失了,记得做个空载体对照;
4楼2010-12-16 12:40:01
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j2

木虫 (正式写手)


tian1203(金币+2): 2010-12-16 14:20:52
我有一次连的酶切出来是目的基因莫名其妙短了1000bp,现在还不晓得原因~
5楼2010-12-16 13:04:51
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)


tian1203(金币+2):应该是最常见的,荧光素酶表达载体 2010-12-16 18:33:55
其实很想知道lz用的是什么载体,什么启动子
7楼2010-12-16 16:51:21
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)


tian1203(金币+2): 2010-12-16 18:34:12
做实验很多时候都会莫名其妙的的现象
8楼2010-12-16 17:23:38
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tian1203

银虫 (著名写手)


9楼2010-12-17 11:31:08
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tian1203

银虫 (著名写手)


还是不知道原因
10楼2010-12-24 10:45:13
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引用回帖:
Originally posted by tian1203 at 2010-12-16 09:52:40:
1200的片段,转进4800的表达载体
阳性克隆检测非常亮且大小正确。提质粒酶切1200的片段也切了下来。

但是,用DL-5000检测发现载体比理论小了1000-2000bp。非常想不明白,
就是说4800的载体+1200的目的基因, ...

楼主你空质粒酶切跑个对照看看,会不会是质粒上面某个位点发生突变,然后刚好被你的酶识别?
11楼2010-12-24 10:50:01
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可可猫

铜虫 (小有名气)


tian1203(金币+2):今天重做,还是同样的问题,郁闷 2010-12-26 14:28:32
我也跟lz遇到相同问题了

转化后发现重组质粒比空质粒大小还要小点
12楼2010-12-24 14:02:40
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sanmaoecho

金虫 (小有名气)


质粒有突变,多了一个酶切位点?可能性很小的吧
13楼2010-12-24 14:50:17
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xiaomu3811

金虫 (小有名气)


tian1203(金币+2):我的去测序,直接就失败 2010-12-26 14:29:00
引用回帖:
Originally posted by tian1203 at 2010-12-16 09:52:40:
1200的片段,转进4800的表达载体
阳性克隆检测非常亮且大小正确。提质粒酶切1200的片段也切了下来。

但是,用DL-5000检测发现载体比理论小了1000-2000bp。非常想不明白,
就是说4800的载体+1200的目的基因, ...

我也遇到了同样的情况,不知道是什么原因,我插入了一个约1800的片段,但是构建好的重组载体竟然比空载体小很多,但是我测序后证明了确实有我的目的片段插入。实在是解释不了,希望高手解答!

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14楼2010-12-24 16:54:36
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tian1203

银虫 (著名写手)


一个月了,还是这样。到底是啥原因???
15楼2010-12-26 14:30:54
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tian1203

银虫 (著名写手)


16楼2010-12-26 14:38:30
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tian1203

银虫 (著名写手)


连接前后
17楼2010-12-26 14:38:49
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frankstone

铜虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
可能质粒并没有减小,因为marker是线性DNA,和环状质粒的电泳行为有差异是很正常的。另外,酶切后上样量有点大,也会影响电泳的。如果想验证,可以用不同的酶切试试。供参考吧。
18楼2012-06-26 18:32:13
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caveolim1

新虫 (初入文坛)


19楼2015-09-25 21:41:32
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淡水生烟

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by xiaomu3811 at 2010-12-24 16:54:36
我也遇到了同样的情况,不知道是什么原因,我插入了一个约1800的片段,但是构建好的重组载体竟然比空载体小很多,但是我测序后证明了确实有我的目的片段插入。实在是解释不了,希望高手解答!...

你好,我现在也遇到过了这种情况,就是重组质粒比空白对照小。请问你是怎么解决的那
20楼2015-11-20 21:40:40
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简单回复
2010-12-16 13:12   回复  
tian1203(金币+2): 2010-12-16 14:21:07
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