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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】片段转进去，提质粒酶切发现载体小了，想不明白
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tian1203

银虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】片段转进去，提质粒酶切发现载体小了，想不明白

1200的片段，转进4800的表达载体
阳性克隆检测非常亮且大小正确。提质粒酶切1200的片段也切了下来。

但是，用DL-5000检测发现载体比理论小了1000-2000bp。非常想不明白，
就是说4800的载体+1200的目的基因，单酶切后理论上应该6000，为啥我的片段看着不到5000？？质粒断了？？

可以确定不是空载体，550的片段以前也出现过这种情况
DL-5000没问题，因为同时跑了DL-2000。
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1楼 2010-12-16 09:52:40
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tian1203

银虫 (著名写手)
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2楼2010-12-16 10:11:58
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tian1203

银虫 (著名写手)
手机拍的，质量不好。请教各位高手原因
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3楼2010-12-16 10:13:10
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
★
dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-12-16 12:57:44
tian1203(金币+2): 2010-12-16 14:20:36
tian1203(金币+1):菌长的不多，其它的菌也是如此 2010-12-16 15:02:34
可以多挑几个阳性克隆，看看是不是都是这个情况
也可以尝试其他酶的双酶切，以至于3酶切，可以粗略估计哪一段缺失了，记得做个空载体对照；
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4楼2010-12-16 12:40:01
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j2

木虫 (正式写手)
tian1203(金币+2): 2010-12-16 14:20:52
我有一次连的酶切出来是目的基因莫名其妙短了1000bp，现在还不晓得原因~
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5楼2010-12-16 13:04:51
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)
tian1203(金币+2):应该是最常见的，荧光素酶表达载体 2010-12-16 18:33:55
其实很想知道lz用的是什么载体，什么启动子
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7楼2010-12-16 16:51:21
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rainwander

铁杆木虫 (知名作家)
tian1203(金币+2): 2010-12-16 18:34:12
做实验很多时候都会莫名其妙的的现象
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8楼2010-12-16 17:23:38
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tian1203

银虫 (著名写手)
求助
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9楼2010-12-17 11:31:08
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tian1203

银虫 (著名写手)
还是不知道原因
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10楼2010-12-24 10:45:13
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brightfuture01

木虫之王 (文坛精英)
引用回帖:
Originally posted by tian1203 at 2010-12-16 09:52:40:
1200的片段，转进4800的表达载体
阳性克隆检测非常亮且大小正确。提质粒酶切1200的片段也切了下来。

但是，用DL-5000检测发现载体比理论小了1000-2000bp。非常想不明白，
就是说4800的载体+1200的目的基因， ...

楼主你空质粒酶切跑个对照看看，会不会是质粒上面某个位点发生突变，然后刚好被你的酶识别？
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11楼2010-12-24 10:50:01
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可可猫

铜虫 (小有名气)
tian1203(金币+2):今天重做，还是同样的问题，郁闷 2010-12-26 14:28:32
我也跟lz遇到相同问题了

转化后发现重组质粒比空质粒大小还要小点
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12楼2010-12-24 14:02:40
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sanmaoecho

金虫 (小有名气)
质粒有突变，多了一个酶切位点？可能性很小的吧
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13楼2010-12-24 14:50:17
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xiaomu3811

金虫 (小有名气)
tian1203(金币+2):我的去测序，直接就失败 2010-12-26 14:29:00
引用回帖:
Originally posted by tian1203 at 2010-12-16 09:52:40:
1200的片段，转进4800的表达载体
阳性克隆检测非常亮且大小正确。提质粒酶切1200的片段也切了下来。

但是，用DL-5000检测发现载体比理论小了1000-2000bp。非常想不明白，
就是说4800的载体+1200的目的基因， ...

我也遇到了同样的情况，不知道是什么原因，我插入了一个约1800的片段，但是构建好的重组载体竟然比空载体小很多，但是我测序后证明了确实有我的目的片段插入。实在是解释不了，希望高手解答！
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淡水生烟
14楼2010-12-24 16:54:36
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tian1203

银虫 (著名写手)
一个月了，还是这样。到底是啥原因？？？
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15楼2010-12-26 14:30:54
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tian1203

银虫 (著名写手)
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16楼2010-12-26 14:38:30
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tian1203

银虫 (著名写手)
连接前后
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17楼2010-12-26 14:38:49
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frankstone

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
可能质粒并没有减小，因为marker是线性DNA，和环状质粒的电泳行为有差异是很正常的。另外，酶切后上样量有点大，也会影响电泳的。如果想验证，可以用不同的酶切试试。供参考吧。
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18楼2012-06-26 18:32:13
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caveolim1

新虫 (初入文坛)
同问
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19楼2015-09-25 21:41:32
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淡水生烟

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
送红花一朵
引用回帖:
14楼: Originally posted by xiaomu3811 at 2010-12-24 16:54:36
我也遇到了同样的情况，不知道是什么原因，我插入了一个约1800的片段，但是构建好的重组载体竟然比空载体小很多，但是我测序后证明了确实有我的目的片段插入。实在是解释不了，希望高手解答！...

你好，我现在也遇到过了这种情况，就是重组质粒比空白对照小。请问你是怎么解决的那
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20楼2015-11-20 21:40:40
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简单回复
catsupport6楼
2010-12-16 13:12   回复  
tian1203(金币+2): 2010-12-16 14:21:07
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