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Ella14

银虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】大家酶切载体怎么切？一般切多久？已有4人参与

大家酶切载体怎么切？一般切多久？最近挑克隆总是不见阳性的。做了载体对照，张得很好，1UG，1U的酶，切过夜。。。去磷。。。

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1楼 2010-10-11 22:05:07

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ben1147

木虫 (正式写手)

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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-13 08:39:19

挑克隆没有阳性的话，要分你酶切之后是否切胶回收了
如果切胶回收了，那假阳性应该是载体自连引起的，可能是去磷酸化不完全

如果没有切胶回收，直接拿酶切体系纯化后做连接，那么没切开和自连都有可能导致假阳性。区分方法就是用酶切产物直接做转化，如果也长，就说明有剩余没切开的质粒，要延长酶切时间（如果已经切过夜，应该不是时间问题）、加大酶量，或者检查一下酶切体系离子浓度或者酶切温度是否有问题；如果不长，那就还是自连引起的

至于载体和片段比例，对于去磷酸化或者双酶切的载体来说，没必要十分严格。至少我基本上就不会去关心浓度比，只要载体和片段质量过关，并且有一定的量，理论上不会出问题

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5楼2010-10-12 12:39:36

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zjzz

木虫 (正式写手)

在通往变态的坦途上

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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-10-12 08:34:47

我一般1U的载体，做20ul体系先加第一种酶切3~4h，取1ul跑胶检测酶切完全。如不完全继续切
然后将体系扩到40ul加第二种酶一般切两个小时后胶回收。
不做去磷酸化。
一般3kbp左右的载体取100ng做酶连，外源片段对载体摩尔比在3~6：1左右快速酶连1小时或一般的16°过夜
基本每次都能连上

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终于熬成木虫了……