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chener

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】载体酶切和连接 已有10人参与

请问各位高手,我的载体是用Xba I(粘性末端)和SmaI(平末端)进行双酶切的,请问我用T4 DNA连接酶和我的目的片段连接的时候,载体用不用去磷酸化,不去磷酸化载体会不会自连啊?

[ Last edited by lstt09nk on 2010-6-3 at 19:11 ]
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长

chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:20
控制好酶连的时间 应该问题不大
个人意见 仅供参考
尔非我焉知我悲喜
2楼2010-06-03 20:31:10
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)


amisking(金币+1):欢迎交流。 2010-06-03 21:55:21
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:28
不会自连,连接时可参照平末端连接方法,温度用22度4小时-6小时,(如果T4酶用的是fermenantas)效果比16度过夜要好。这是我个人的心得,仅供参考。
3楼2010-06-03 20:47:18
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主

chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:33
应该不会自连的,连接效率应该会挺高的。。。
几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-06-03 21:39:44
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)

chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:38
去磷酸化没有必要!
5楼2010-06-03 21:50:31
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螺旋技术

新虫 (正式写手)

chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:46
去磷酸化没有必要, 连接效率应该没有粘性末端高。
6楼2010-06-03 23:12:04
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风荻

金虫 (小有名气)


chener(金币+1):谢谢参与
我现在也遇到了和楼主相同的问题,两个酶,一个是Not1粘性末端,一个是Snab1平末端。单酶切和双眉切都试过了,可是每次都挑了茫茫多的转化子,没有一个是阳性的,苦恼啊!!!
7楼2010-06-06 12:02:06
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tomocsn

铁虫 (初入文坛)

同求+我的尝试

★ ★ ★
chener(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):感谢分享经验~~ 2010-06-07 14:47:01
我也遇到了这样的问题,用的是pst1 和 Ehe1酶切出的平黏端,但是尝试过好多没连上!方法有:尝试不加PEG;尝试1:3-1:15之间的一部分比例同时转化一个平板。用的是takara的t4酶。16°过夜连接。
生命不息奋斗不止
8楼2010-06-07 11:53:50
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主


chener(金币+1):谢谢参与
需要你先看一下你的连接效率和假阳性的高低
9楼2010-06-07 11:56:31
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)

版主


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖
smaI和XbaI,我的怎么切不开呢??请问一个不是25度另一个不是37度,这两个怎么切得??求指教??
红砖并进,理实交融!
10楼2012-03-06 16:20:29
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