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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】载体酶切和连接
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chener

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】载体酶切和连接 已有10人参与

请问各位高手，我的载体是用Xba I（粘性末端）和SmaI(平末端）进行双酶切的，请问我用T4 DNA连接酶和我的目的片段连接的时候，载体用不用去磷酸化，不去磷酸化载体会不会自连啊？

[ Last edited by lstt09nk on 2010-6-3 at 19:11 ]
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1楼 2010-06-03 19:03:28
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:20
控制好酶连的时间 应该问题不大
个人意见 仅供参考
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尔非我焉知我悲喜
2楼2010-06-03 20:31:10
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
amisking(金币+1):欢迎交流。 2010-06-03 21:55:21
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:28
不会自连，连接时可参照平末端连接方法，温度用22度4小时-6小时，（如果T4酶用的是fermenantas）效果比16度过夜要好。这是我个人的心得，仅供参考。
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3楼2010-06-03 20:47:18
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:33
应该不会自连的，连接效率应该会挺高的。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-06-03 21:39:44
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ljsh

铁杆木虫 (著名写手)
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:38
去磷酸化没有必要！
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5楼2010-06-03 21:50:31
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螺旋技术

新虫 (正式写手)
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:46
去磷酸化没有必要, 连接效率应该没有粘性末端高。
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6楼2010-06-03 23:12:04
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风荻

金虫 (小有名气)
★
chener(金币+1):谢谢参与
我现在也遇到了和楼主相同的问题，两个酶，一个是Not1粘性末端，一个是Snab1平末端。单酶切和双眉切都试过了，可是每次都挑了茫茫多的转化子，没有一个是阳性的，苦恼啊！！！
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7楼2010-06-06 12:02:06
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tomocsn

铁虫 (初入文坛)

同求+我的尝试

★ ★ ★
chener(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):感谢分享经验~~ 2010-06-07 14:47:01
我也遇到了这样的问题，用的是pst1 和 Ehe1酶切出的平黏端，但是尝试过好多没连上！方法有：尝试不加PEG;尝试1：3-1：15之间的一部分比例同时转化一个平板。用的是takara的t4酶。16°过夜连接。
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生命不息奋斗不止
8楼2010-06-07 11:53:50
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
chener(金币+1):谢谢参与
需要你先看一下你的连接效率和假阳性的高低
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9楼2010-06-07 11:56:31
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chenzhu198

铁杆木虫 (著名写手)

版主
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
smaI和XbaI，我的怎么切不开呢？？请问一个不是25度另一个不是37度，这两个怎么切得？？求指教？？
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红砖并进，理实交融！
10楼2012-03-06 16:20:29
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