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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】载体酶切和连接
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chener

金虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】载体酶切和连接 已有10人参与

请问各位高手，我的载体是用Xba I（粘性末端）和SmaI(平末端）进行双酶切的，请问我用T4 DNA连接酶和我的目的片段连接的时候，载体用不用去磷酸化，不去磷酸化载体会不会自连啊？

[ Last edited by lstt09nk on 2010-6-3 at 19:11 ]
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1楼 2010-06-03 19:03:28
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tomocsn

铁虫 (初入文坛)

同求+我的尝试

★ ★ ★
chener(金币+1):谢谢参与
lstt09nk(金币+2):感谢分享经验~~ 2010-06-07 14:47:01
我也遇到了这样的问题，用的是pst1 和 Ehe1酶切出的平黏端，但是尝试过好多没连上！方法有：尝试不加PEG;尝试1：3-1：15之间的一部分比例同时转化一个平板。用的是takara的t4酶。16°过夜连接。
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生命不息奋斗不止
8楼2010-06-07 11:53:50
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sdluqun

铁杆木虫 (著名写手)

板砖队长
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:20
控制好酶连的时间 应该问题不大
个人意见 仅供参考
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尔非我焉知我悲喜
2楼2010-06-03 20:31:10
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yzuxhq368

金虫 (小有名气)
★
amisking(金币+1):欢迎交流。 2010-06-03 21:55:21
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:28
不会自连，连接时可参照平末端连接方法，温度用22度4小时-6小时，（如果T4酶用的是fermenantas）效果比16度过夜要好。这是我个人的心得，仅供参考。
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3楼2010-06-03 20:47:18
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
chener(金币+5): 2010-06-03 23:41:33
应该不会自连的，连接效率应该会挺高的。。。
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
4楼2010-06-03 21:39:44
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