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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】单酶切载体竟然没切开，寻求原因？？
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

[交流] 【求助/交流】单酶切载体竟然没切开，寻求原因？？ 已有5人参与

我用的载体是5500bp，酶是XmaI，去过磷酸化的。这个酶切已经做过n多次了，插入基因就是没办法和载体连接上，自连现象严重。当时以为是去磷酸化步骤的问题，然后就做过2次去磷酸化。
     后来在做完酶切后做了一个转化，将50ng酶切液用电子穿孔仪转入感受态细胞，隔夜培养后发现n多菌斑，那就是意味着没有酶切成功，心里这个郁闷啊！
     我用的这个酶据说是比较难反应的，所以当时酶切都是隔夜至少10个小时以上了！！

     我现在真的是一点办法也没有了，本来就是新手，第一次做，竟然还碰到这么大的问题，3个月了，一点进展都没有，着急啊！
     恳请高手们给点建议，小虾米在这多谢了！！
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开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
1楼 2010-02-08 20:19:51
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
这个酶还可以啊，不是那么的难切，载体酶切后要用CIP去磷酸化一下，你的去磷酸化石如何处理的？
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2010-02-08 22:04:25
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by gyesang at 2010-02-08 22:04:25:
这个酶还可以啊，不是那么的难切，载体酶切后要用CIP去磷酸化一下，你的去磷酸化石如何处理的？

我用SAP，是Promega公司的。怀疑过去磷酸化出状况，可是现在貌似状况在酶切上。
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3楼2010-02-08 22:25:47
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biogefart

木虫 (著名写手)
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
这种情况换个其他公司的酶试试
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闹太套
4楼2010-02-09 01:22:17
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yang0071

木虫 (职业作家)
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
酶切反应体系是多少？
酶的比例？并不是酶越多越好的，注意吸酶时，枪头不要挂液滴
反应时间太长，会很多水蒸发到盖子上，体系就变了，基本上2-3小时足够了
换个公司的酶也是个选择
只需要在载体上去磷酸化，目的片段不要去磷酸化，CIAP挺好用的
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5楼2010-02-09 10:51:07
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
我通常反应体系是2ng，30ul。3ulbuffer，3ul  bsa， 1ul酶，反应3小时，但是总不奏效，后来看过产品说明，说这个酶推荐在37度16小时过夜反应的。后来就这么干了，结果还是不好。

是不是我体系总体积太大了，缩小点可行不
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6楼2010-02-09 20:43:23
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wangjiasi

木虫 (正式写手)
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
体系不大，可以再大一些，然后加大酶量~
2ng？？太少了吧
酶切后可以跑电泳看看是否切开了，如果一点都没切开可能是甲基化的问题
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7楼2010-02-11 13:50:28
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
在酶切完，纯化后，我做了转移，第二天看板子发现菌斑很多（估计500以上）。后来不甘心有做了去磷酸化，又做了次转移，二次发现还是很多菌斑但是明显少于未去磷酸化的板子。
这个能说明什么不？


下面是酶切凝胶回收的图，貌似不太好，不敢确定！！

左边是酶切的载体，右边是对照未酶切的载体

[ Last edited by 听雪看山 on 2010-2-11 at 16:23 ]
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8楼2010-02-11 16:21:59
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听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
做了2组酶切
这个体系总量2ng，20ul。2ul酶，2ulBSA，2ul Buffer 37度16小时酶切。
凝胶电泳只用1ul检测，载体直接用试剂盒纯化。

分别也是在酶切后和去磷酸化后做了转移，查看菌斑情况，结果和上面一组相同

下面是酶切电泳图，左是酶切载体，右面是未酶切载体
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9楼2010-02-11 16:31:06
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听雪看山

木虫 (职业作家)

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引用回帖:
Originally posted by biogefart at 2010-02-09 01:22:17:
这种情况换个其他公司的酶试试

老板怎么会轻易换呢，何况这个也没用完，人家其他人用都好着呢，就我这菜鸟的问题多！ 不过老板认为这个试剂公司的没很好啊！呜呜，再给个可行的办法噻
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10楼2010-02-11 16:34:00
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