应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】单酶切载体竟然没切开，寻求原因？？
161/2返回列表12下一页
查看: 2975  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主

[交流] 【求助/交流】单酶切载体竟然没切开，寻求原因？？ 已有5人参与

我用的载体是5500bp，酶是XmaI，去过磷酸化的。这个酶切已经做过n多次了，插入基因就是没办法和载体连接上，自连现象严重。当时以为是去磷酸化步骤的问题，然后就做过2次去磷酸化。
     后来在做完酶切后做了一个转化，将50ng酶切液用电子穿孔仪转入感受态细胞，隔夜培养后发现n多菌斑，那就是意味着没有酶切成功，心里这个郁闷啊！
     我用的这个酶据说是比较难反应的，所以当时酶切都是隔夜至少10个小时以上了！！

     我现在真的是一点办法也没有了，本来就是新手，第一次做，竟然还碰到这么大的问题，3个月了，一点进展都没有，着急啊！
     恳请高手们给点建议，小虾米在这多谢了！！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
1楼 2010-02-08 20:19:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
这个酶还可以啊，不是那么的难切，载体酶切后要用CIP去磷酸化一下，你的去磷酸化石如何处理的？
赞一下(1人) 回复此楼
学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
2楼2010-02-08 22:04:25
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by gyesang at 2010-02-08 22:04:25:
这个酶还可以啊，不是那么的难切，载体酶切后要用CIP去磷酸化一下，你的去磷酸化石如何处理的？

我用SAP，是Promega公司的。怀疑过去磷酸化出状况，可是现在貌似状况在酶切上。
赞一下 回复此楼
开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
3楼2010-02-08 22:25:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

biogefart

木虫 (著名写手)
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
这种情况换个其他公司的酶试试
赞一下(1人) 回复此楼
闹太套
4楼2010-02-09 01:22:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yang0071

木虫 (职业作家)
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
酶切反应体系是多少？
酶的比例？并不是酶越多越好的，注意吸酶时，枪头不要挂液滴
反应时间太长，会很多水蒸发到盖子上，体系就变了，基本上2-3小时足够了
换个公司的酶也是个选择
只需要在载体上去磷酸化，目的片段不要去磷酸化，CIAP挺好用的
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2010-02-09 10:51:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
我通常反应体系是2ng，30ul。3ulbuffer，3ul  bsa， 1ul酶，反应3小时，但是总不奏效，后来看过产品说明，说这个酶推荐在37度16小时过夜反应的。后来就这么干了，结果还是不好。

是不是我体系总体积太大了，缩小点可行不
赞一下 回复此楼
开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
6楼2010-02-09 20:43:23
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wangjiasi

木虫 (正式写手)
★
听雪看山(金币+1):谢谢参与
体系不大，可以再大一些，然后加大酶量~
2ng？？太少了吧
酶切后可以跑电泳看看是否切开了，如果一点都没切开可能是甲基化的问题
赞一下(1人) 回复此楼
7楼2010-02-11 13:50:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
在酶切完，纯化后，我做了转移，第二天看板子发现菌斑很多（估计500以上）。后来不甘心有做了去磷酸化，又做了次转移，二次发现还是很多菌斑但是明显少于未去磷酸化的板子。
这个能说明什么不？


下面是酶切凝胶回收的图，貌似不太好，不敢确定！！

左边是酶切的载体，右边是对照未酶切的载体

[ Last edited by 听雪看山 on 2010-2-11 at 16:23 ]
赞一下 回复此楼
开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
8楼2010-02-11 16:21:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
做了2组酶切
这个体系总量2ng，20ul。2ul酶，2ulBSA，2ul Buffer 37度16小时酶切。
凝胶电泳只用1ul检测，载体直接用试剂盒纯化。

分别也是在酶切后和去磷酸化后做了转移，查看菌斑情况，结果和上面一组相同

下面是酶切电泳图，左是酶切载体，右面是未酶切载体
赞一下 回复此楼
开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
9楼2010-02-11 16:31:06
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

听雪看山

木虫 (职业作家)

西游家族之T所长

优秀版主优秀版主
引用回帖:
Originally posted by biogefart at 2010-02-09 01:22:17:
这种情况换个其他公司的酶试试

老板怎么会轻易换呢，何况这个也没用完，人家其他人用都好着呢，就我这菜鸟的问题多！ 不过老板认为这个试剂公司的没很好啊！呜呜，再给个可行的办法噻
赞一下 回复此楼
开花可要欣赏，然后就去远行；唯有不等花开，才能记得花红。
10楼2010-02-11 16:34:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 听雪看山 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +37 医学老男孩 2026-08-13 86/4300 2026-08-18 00:18 by longsantaizi
[基金申请] 感觉是下周放榜了 +6 angus9576 2026-08-17 11/550 2026-08-17 23:57 by angus9576
[基金申请] filecode=后面第一个是大写字母 +8 wangze12014 2026-08-14 10/500 2026-08-17 17:05 by xter9665
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +4 基诺咪客 2026-08-17 4/200 2026-08-17 16:10 by Vivilian
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +8 zju2000 2026-08-16 9/450 2026-08-17 12:20 by lmz0216
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +13 archvillain 2026-08-15 25/1250 2026-08-16 20:13 by zhaosm1982
[基金申请] 2027广东省杰青 +3 奶牛小黑 2026-08-15 6/300 2026-08-16 20:07 by 奶牛小黑
[基金申请] 咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否 +7 启萌科技 2026-08-12 26/1300 2026-08-16 12:35 by 启萌科技
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +10 majunge000 2026-08-11 12/600 2026-08-16 08:18 by xli1984
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 是这周出结果还是下周出结果？ +4 yuleib84 2026-08-11 4/200 2026-08-14 23:05 by lfy8008
[硕博家园] 读博的好处 +4 lnee 2026-08-11 4/200 2026-08-14 10:20 by ahsoarli
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 分享一下我之前已中青C的计划书的filecode +4 布布和一二 2026-08-11 5/250 2026-08-13 12:56 by cratir
[基金申请] 结合人工智能，周易传统文化，filecode打分制来了，3分以上希望很大。 +3 Tide man 2026-08-12 4/200 2026-08-13 08:35 by ZJTJZ
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +11 Tide man 2026-08-11 11/550 2026-08-13 07:35 by 撸猫猫
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭