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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分步酶切 回收 求助
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gsf313

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】分步酶切 回收 求助 已有13人参与

我切一个载体，Ecor I 和 Xho I，宝生物的酶，这两个酶的buffer都是1xk

因为两个酶切位点之间只差6个碱基，所以同时双酶切老是切不开。分步酶切的话，第一次用Ecor I切完，用胶回收试剂盒回收片段，再 Xho I切。第二次回收，总是收不回来片段。

我现在想用30/50ul 体系，先 1ul Ecor I ，3ul 10XK buffer，10ul 质粒，补水到30ul，切三个小时，不回收，直接再加2ul 10XK buffer,1.5ul Xho I，加水补到50ul，再切三小时，大家看可行么？给点建议啊，我快急疯了，眼看就毕不了业了……

补充一些疑问点：1。第一次酶切后，需不需要加热使酶失活，然后再进行下一步？如果需要，怎么加热？多少度？加热多久？

2。加第二个酶的时候，10XK buffer 加5ul 还是3ul？ 因为两个酶的buffer一样，所以有此疑问
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1楼 2010-06-25 23:56:39
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xiangyunch

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一般情况下65度十分钟就可以使酶失活
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2楼2010-06-26 08:43:41
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珊瑚木子

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+1):谢谢交流 2010-06-26 11:13:49
我觉得酶是应该灭一下的，好像在酶试剂说明书上见过有终止反应的试剂，你可以再去看看。
第二次这样加buffer 好像不是可以完全确定到底加多少吧？
或许你可以换一下切得顺序。
不是太懂，接供参考。
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3楼2010-06-26 08:50:11
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gsf313

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 珊瑚木子 at 2010-06-26 01:50:11:
我觉得酶是应该灭一下的，好像在酶试剂说明书上见过有终止反应的试剂，你可以再去看看。
第二次这样加buffer 好像不是可以完全确定到底加多少吧？
或许你可以换一下切得顺序。
不是太懂，接供参考。

说明书上写了，我们跑胶用的loading buffer就含反应终止成分，但是不知道该怎么加量，加完以后是否需要纯化，这个，有高人知道么？
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4楼2010-06-26 09:16:47
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ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gsf313 at 2010-06-26 09:16:47:

说明书上写了，我们跑胶用的loading buffer就含反应终止成分，但是不知道该怎么加量，加完以后是否需要纯化，这个，有高人知道么？

限制酶配的loading buffer里面有SDS，加了以后酶失活，只能再跑电泳之前用。后面还要酶切的话就不能用

第一次切完最好纯化一下，或者酚氯仿抽提乙醇沉淀，或者过柱子纯化。重新溶了以后再切第二次

酶切位点离得太近的话双酶切切不开很常见，分步切有可能改善，但是跟切的顺序有关。建议你先EcoR I后Xho I和先Xho I后EcoR I都试一下。
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5楼2010-06-26 09:58:53
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j2

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
只差6个碱基，请问是怎么知道没切开的？是没成线性还是其中一个没切开？
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修炼ｉｎｇ，当虫仙……
6楼2010-06-26 11:00:07
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gsf313

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by j2 at 2010-06-26 04:00:07:
只差6个碱基，请问是怎么知道没切开的？是没成线性还是其中一个没切开？

单酶切均可切开，同时双酶切也做过，可是转化后一个菌落都没长出来，所以估计是没有切开
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7楼2010-06-26 11:09:42
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月月大可

木虫 (著名写手)
★ ★
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dhd997(金币+1):谢谢交流。 2010-06-26 12:10:33
可以尝试一下第一次酶切完回收的时候不要电泳，而是直接加入溶胶Buffer，然后挂柱子，一下做法完全按照说明书操作。洗脱的时候小体系。30微升甚至都可以20-25微升，洗下来后全部用于第二次酶切。第二次酶切结束后电泳、回收！

这样减少一次电泳，能减少一些损失。
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8楼2010-06-26 12:06:48
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gsf313

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 月月大可 at 2010-06-26 05:06:48:
可以尝试一下第一次酶切完回收的时候不要电泳，而是直接加入溶胶Buffer，然后挂柱子，一下做法完全按照说明书操作。洗脱的时候小体系。30微升甚至都可以20-25微升，洗下来后全部用于第二次酶切。第二次酶切结束后 ...

非常感谢，我准备试试
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9楼2010-06-26 12:27:56
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
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引用回帖:
Originally posted by gsf313 at 2010-06-26 11:09:42:


单酶切均可切开，同时双酶切也做过，可是转化后一个菌落都没长出来，所以估计是没有切开

应该不是这么分析的吧，如果一个都没长，如果其他操作无误的话，只能说明，双酶切很完全，因为没连上片段所以不长。如果只是单酶切开的话，肯定会有很多自连，是长很多，而不是不长。
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Thank-you，so-blue.
10楼2010-06-28 11:22:46
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