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gsf313

铁虫 (小有名气)

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[交流] 【求助/交流】分步酶切回收求助已有13人参与

我切一个载体，Ecor I 和 Xho I，宝生物的酶，这两个酶的buffer都是1xk

因为两个酶切位点之间只差6个碱基，所以同时双酶切老是切不开。分步酶切的话，第一次用Ecor I切完，用胶回收试剂盒回收片段，再 Xho I切。第二次回收，总是收不回来片段。

我现在想用30/50ul 体系，先 1ul Ecor I ，3ul 10XK buffer，10ul 质粒，补水到30ul，切三个小时，不回收，直接再加2ul 10XK buffer,1.5ul Xho I，加水补到50ul，再切三小时，大家看可行么？给点建议啊，我快急疯了，眼看就毕不了业了……

补充一些疑问点：1。第一次酶切后，需不需要加热使酶失活，然后再进行下一步？如果需要，怎么加热？多少度？加热多久？

2。加第二个酶的时候，10XK buffer 加5ul 还是3ul？因为两个酶的buffer一样，所以有此疑问

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1楼 2010-06-25 23:56:39

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gsf313

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引用回帖:

Originally posted by 月月大可 at 2010-06-26 05:06:48:
可以尝试一下第一次酶切完回收的时候不要电泳，而是直接加入溶胶Buffer，然后挂柱子，一下做法完全按照说明书操作。洗脱的时候小体系。30微升甚至都可以20-25微升，洗下来后全部用于第二次酶切。第二次酶切结束后 ...

非常感谢，我准备试试