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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】双酶切求助
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tian1203

银虫 (著名写手)

[交流] 【求助/交流】双酶切求助

用fermentas公司的Kpn1和Xho1双酶切Pmd-t18simple上的目的片段
只是普通酶，没有通用Buffer，所以分步酶切
第一步：
                    2ul       10X TangoBuffer
                    2ul        Kpn1
                    10ul      质粒
                    6ul        ddH2O
            37度5h


第二步：
                 6ul      10X TangoBuffer
                 2ul        Xho1
                 12ul     ddH2O
             37度5h      

出现的问题：2个月前可以切下550bp的片段
                      现在相同的方法350bp，550bp,900bp,1200bp,1700bp却啥也且不下来。请求帮助
                  根据fermentas公司的建议方法也没切下来。

小弟实验新手，恳求各位帮助，或者关于双酶切的任何建议
不胜感激！
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别紧张，我不是什么好人...
1楼 2010-10-28 10:58:32
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
tian1203(金币+1):谢谢参与
tian1203(金币+2): 2010-10-28 11:22:04
用Fermentas的快酶吧，所有的酶buffer都通用的。
赞一下(1人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
2楼2010-10-28 11:14:01
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tian1203

银虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by susizheng at 2010-10-28 11:14:01:
用Fermentas的快酶吧，所有的酶buffer都通用的。

我问了价格，比普通的贵很多。现在还有很多普通的酶没用完。
FastDigest®限制酶效果真的那么神奇吗？
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别紧张，我不是什么好人...
3楼2010-10-28 11:25:27
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主
★
tian1203(金币+1):谢谢参与
tian1203(金币+2): 2010-10-28 13:27:13
公司没有推荐双酶切的buffer ？
赞一下(1人) 回复此楼
4楼2010-10-28 11:42:21
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孤枫

金虫 (小有名气)
★
tian1203(金币+1):谢谢参与
会不会是引物上的酶切位点有错咧，或者PCR的时候酶切位点刚好出错了
赞一下(1人) 回复此楼
5楼2010-10-28 11:56:10
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gwd0312

木虫 (正式写手)

“无冕之王”
★
tian1203(金币+1):谢谢参与
如果酶切位点没有错，你可以试一下双酶切啊，可以试一下1M buffer
赞一下(1人) 回复此楼
持之以恒、永不放弃！
6楼2010-10-28 12:51:50
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷
★
tian1203(金币+1):谢谢参与
tian1203(金币+1): 2010-10-28 17:44:47
引用回帖:
Originally posted by tian1203 at 2010-10-28 11:25:27:

我问了价格，比普通的贵很多。现在还有很多普通的酶没用完。
FastDigest®限制酶效果真的那么神奇吗？

也不是那么神奇，就是速度快，然后buffer通用。一般酶切10-20 min就可以做后续实验了。
赞一下(1人) 回复此楼
Thank-you，so-blue.
7楼2010-10-28 15:32:28
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virus2009

金虫 (正式写手)

人称 龙哥
★
tian1203(金币+1):谢谢参与
tian1203(金币+3):谢谢！应该是5u/ul。酶中的甘油为50%，刚好为总体积的5% 2010-10-28 17:51:59
tian1203(金币+2): 2010-10-28 18:07:40
LZ用的酶的单位是多少？20ul体系用2ul酶太多了？酶中加有甘油，酶加多了相应的甘油浓度也会加大，甘油将影响酶切的效果，建议测量一下质粒浓度后，根据浓度加酶，宁可少点酶多切点时间，不要加太多酶？可以少量酶切过夜！
赞一下(1人) 回复此楼
virus
8楼2010-10-28 15:57:43
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tian1203

银虫 (著名写手)
★ ★
scelab(金币+2):欢迎上图 2010-10-28 23:04:22

把酶从原来的2ul减少到1.8ul，第二个片段550的切了下来，但是为啥效果不好？
第一个350bp和第三个1200bp的片段，同样的酶切位点为何且不下来？

每步都是37度5h，是时间太短还是酶加多了甘油抑制了酶活性，还是其他原因？

实验新手请求帮助！非常感谢！
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别紧张，我不是什么好人...
9楼2010-10-28 22:37:47
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tian1203

银虫 (著名写手)
手机拍的图片效果不好
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别紧张，我不是什么好人...
10楼2010-10-28 22:38:51
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