24小时热门版块排行榜    

北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
查看: 4531  |  回复: 4

sipin210

新虫 (初入文坛)

[求助] 【求助/交流】酶切后的粘性末端补平

最近在改造载体,想先将基础载体酶切,得到粘性末端,然后用takara的dna blunting kit补平,再进行平端的连接。做了一次,没有筛到阳性克隆。请问大家有blunting的经验吗?
还有,我可不可以将高保真酶和酶切回收产物72度共浴,从而利用高保真酶的3‘-5’外切酶活性把粘性末端切平呀?
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

空谷幽风

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-08-08 18:20:15
1.你的做法理论上是完全可行的,但实验没成功还只自己找找原因,另外补平后建议做一下载体的去磷酸化。
2.将高保真酶和酶切回收产物72度共浴个人感觉这样做不行,也没见到过有这么做补平的
a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
2楼2011-08-08 12:15:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

sipin210(金币+1): thx~很有用,很多想法我都会试试看能不能成功~ 2011-08-09 10:08:09
lz是那端突出,你考虑用哪种酶不仅仅要考虑是否有活性,还要考虑活性的大小,不同酶的外切酶活性有的是针对粘端,有的是针对平端,有的甚至内凹也能切~~~
lz关于自连可以看看这个
http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2941363
3楼2011-08-09 09:25:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

shaquila

金虫 (正式写手)

自连时候一定要小心,klenow和t4 pol反应条件要掌握好就没事了
如果用接头,基本没有什么要注意的,就是体系正确很容易连接
4楼2011-08-09 13:43:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

sipin210

新虫 (初入文坛)

谢谢啦~上一次blunting失败,我分步双酶切质粒之后做了胶回收,并补平,直接连我的平端的目的片段,长了四十多个斑,鉴定都没有连上我的目的片段55.。。
我这两天打算再做一次补平,用试剂盒和高保真延伸都试一下。
我仔细看了一下,我用EcoRI和HindIII双酶切载体,得到了两个5‘的突出端,理论上高保真酶的5’3‘聚合酶活性就会补平粘性末端吧?
然后我估计我的连接过程也存在问题,我的目的片段是重叠pcr得到的,胶回收之后损失很大,这回我大批量回收哎...
5楼2011-08-12 11:06:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 sipin210 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料专硕(0856) 339分求调剂 +8 哈哈哈鹅哈哈哈 2026-04-04 8/400 2026-04-05 12:15 by ujn_zhuj
[考研] 285求调剂 +11 哦呦呼o 2026-04-04 11/550 2026-04-05 08:15 by 544594351
[考研] 282电子信息0854专硕调剂 +4 202451007219 2026-04-02 6/300 2026-04-04 21:55 by laoshidan
[考研] 298求调剂 +5 zzz,,r 2026-04-02 8/400 2026-04-04 19:55 by 蓝云思雨
[考研] 085602 找调剂 +4 逆时针快乐 2026-04-02 4/200 2026-04-04 19:32 by 蓝云思雨
[考研] 321求调剂 +13 认真求上学 2026-04-02 13/650 2026-04-04 18:23 by macy2011
[考研] 求调剂 +3 wos666 2026-04-03 3/150 2026-04-04 05:16 by gswylq
[考研] 一志愿南昌大学324求调剂 +13 hanamiko 2026-04-01 13/650 2026-04-03 18:30 by ls刘帅
[考研] 334求调剂 +9 Trying] 2026-03-31 9/450 2026-04-03 15:18 by 琢珥丶
[考研] 283求调剂 +3 jiouuu 2026-04-03 4/200 2026-04-03 13:28 by jiouuu
[考研] 321求调剂 +17 y-yh 2026-04-01 20/1000 2026-04-03 12:57 by y-yh
[考研] 一志愿安徽大学0817化学工程与技术,求调剂 +14 我不是只因 2026-04-02 15/750 2026-04-03 09:49 by 蓝云思雨
[考研] 一志愿北交大材料工程总分358 +8 cs0106 2026-04-01 9/450 2026-04-02 10:36 by 不吃魚的貓
[考研] 348环境工程调剂 +3 吴彦祖24k 2026-04-01 3/150 2026-04-02 09:14 by nanaliuyun
[考研] 求调剂,一志愿南京师范大学计算机专硕,初试373,六级通过, +3 计算机追梦人 2026-04-01 3/150 2026-04-02 07:57 by fxue1114
[考研] 353求调剂 +4 拉钩不许变 2026-04-01 4/200 2026-04-01 18:10 by 记事本2026
[考研] 生物学296求调剂 +10 汤圆包 2026-03-29 14/700 2026-04-01 10:44 by 求调剂zz
[考研] 318求调剂 +8 七忆77 2026-04-01 8/400 2026-04-01 10:37 by Jaylen.
[考研] 江苏苏北高校诚邀调剂同学 +3 zzll406 2026-03-31 3/150 2026-03-31 16:54 by 及时行乐fan
[考研] 085602 化学工程专硕 340分求调剂 +4 qianbai11 2026-03-29 4/200 2026-03-30 11:34 by 唐沐儿
信息提示
请填处理意见