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sipin210

新虫 (初入文坛)

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[求助] 【求助/交流】酶切后的粘性末端补平

最近在改造载体，想先将基础载体酶切，得到粘性末端，然后用takara的dna blunting kit补平，再进行平端的连接。做了一次，没有筛到阳性克隆。请问大家有blunting的经验吗？
还有，我可不可以将高保真酶和酶切回收产物72度共浴，从而利用高保真酶的3‘-5’外切酶活性把粘性末端切平呀？

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1楼 2011-08-08 11:30:25

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sipin210

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谢谢啦~上一次blunting失败，我分步双酶切质粒之后做了胶回收，并补平，直接连我的平端的目的片段，长了四十多个斑，鉴定都没有连上我的目的片段55.。。
我这两天打算再做一次补平，用试剂盒和高保真延伸都试一下。
我仔细看了一下，我用EcoRI和HindIII双酶切载体，得到了两个5‘的突出端，理论上高保真酶的5’3‘聚合酶活性就会补平粘性末端吧？
然后我估计我的连接过程也存在问题，我的目的片段是重叠pcr得到的，胶回收之后损失很大，这回我大批量回收哎...