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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。
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yehuanren

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。

最近在构建一个载体，最终T-DNA的长度要达到1w bp。请问，这么长的片段，通过农杆菌介导能否顺利的转入植物基因组。听说T-DNA太长的话不好全部转入，有没有哪位同学做过这方面的实验。给点建议！如果盲目的构建将来却转不进去，岂不是很悲催。
      或者， 哪位同学给推荐一个表达载体（质粒），要求：1，质粒较小，目前本人操作的两个载体（pbi121和pksb）都是1.5w bp左右，这也是导致最终T-DNA较长的一个直接原因。2，质粒没有选择标记/抗性标记基因，或者选择标记比较容易切除！如果能找到这样的载体，T-DNA的最终长度会减少很多。
     
     另外还有一个酶切连接的问题。需要在载体中双酶切切去一个片段，然后让剩下的载体大片段自连。现在想了两个方案：1，用平末端连接。2，也是听说平末端比较难连接，试图从该载体中随便pcr扩增一个片段，在上下游引物两端加上我双酶切的那两个酶，然后再和上述的载体大片段连接。觉得第二个办法好笨啊。请问，平末端真的很难操作吗？有做过的同学给点建议吧。在此先谢过了，问题好像比较多啊，菜鸟！我就是一直实验小菜鸟。各位，包含~~

[ Last edited by yehuanren on 2011-3-30 at 01:31 ]
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1楼 2011-03-30 01:01:13
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2011-03-30 13:59:11:
自己试试不就行了？
有发帖顶贴的功夫连接转化都试做一次了

这个高兄说话如此轻松，必定是高手中的高高手，一生也肯定与他人无所求，只是在下不才，实验经历尚浅，纵然百般思虑还是愿意倾听一下同行高人的意见，自是三人必有我师，高君一席话胜读十年书。发此贴也不过此目的而已。并不会因为发帖的须臾功夫而停步实验片刻。您实在多虑了！也谢谢您顶贴，我的实验安排也很好！
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7楼2011-03-30 15:42:39
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yehuanren

新虫 (初入文坛)

自己顶一个

★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-03-30 19:36:57
刚才有查了一些资料。如果是载体片段和目的DNA用平末端连接的话，需要先补平，然后去磷酸化，最后再连接。而且这样还经常出现载体片段自连的现象。一看到载体自连好开心啊，我这个双酶切后本来就是要剩下的片段自连嘛，这样说来，我用平末端是不是要好练一点呢。具体操作又应该如后？？谢谢大家指导
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2楼2011-03-30 02:13:49
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yehuanren

新虫 (初入文坛)

顶

自己顶一个
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3楼2011-03-30 09:38:20
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1949stone

荣誉版主 (知名作家)
★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
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4楼2011-03-30 12:16:21
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-03-30 17:00:26
yehuanren(金币+5): 好的。我这就搜搜看，多谢。有不懂的可能还要劳烦您。呵呵 2011-03-30 20:47:03
yehuanren(金币+26): 2011-04-02 21:04:27
楼主可以搜索我的主题贴，关于线性自连，平端我试过，大家帮助下，挺顺利，但是细节较多，推荐用接头，设计两对引物，直接让它们退火互补，这个是最简单的办法，嘻嘻
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8楼2011-03-30 16:36:28
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shaquila

金虫 (正式写手)
这个接头是自己设计的，上百度找了资料也没说设计多长，描述很模糊，感觉中文实验方法很缺乏阿。我试过连接成功，也就25bp，合成两条五十多，不贵
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9楼2011-03-30 16:39:53
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zhwenxing

木虫 (著名写手)
★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
平头的链接不如黏头的，试试看吧，比较长，再就是预测一下是否有严重的自折叠结构。
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11楼2011-03-30 16:51:04
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lzh860801

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
yehuanren(金币+5): 谢谢您，我明天提完质粒就往下做，先试试再说吧，百闻不如一试。呵呵 2011-03-30 20:46:06
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:32
引用回帖:
Originally posted by yehuanren at 2011-03-30 01:01:13:
最近在构建一个载体，最终T-DNA的长度要达到1w bp。请问，这么长的片段，通过农杆菌介导能否顺利的转入植物基因组。听说T-DNA太长的话不好全部转入，有没有哪位同学做过这方面的实验。给点建议！如果盲目的构建将 ...

不知道LZ这个T-DNA是有特殊目的还是怎么的？
如果是有特殊目的非要这么大片段那在片段上就没什么办法了，
载体方面可以换换其他的载体，不过一般做植物转化的载体都不怎么小，除了一些打基因枪这类的载体，但这些并不适合做普通的转化。
另外关于连接的问题，其实平末端与粘性末端在连接上的成功率个人觉得差别不大，感觉平末端连接困难的原因只是因为载体自连的会比较多，这个只需要在做连接的时候加大片段的量就没多大问题了。但是如果是用平末端连接的话，有的时候往往需要考虑方向的正反。
实际上很多东西做起来并没有那么麻烦。LZ试试就知道了
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12楼2011-03-30 19:12:33
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:49
帖子在这，楼主有空看看把，都是大家帮忙的http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2941363
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13楼2011-03-30 20:55:16
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by lzh860801 at 2011-03-30 19:12:33:
不知道LZ这个T-DNA是有特殊目的还是怎么的？
如果是有特殊目的非要这么大片段那在片段上就没什么办法了，
载体方面可以换换其他的载体，不过一般做植物转化的载体都不怎么小，除了一些打基因枪这类的载体，但 ...

没有特殊目的，也是不得已。想尽可能多的切掉没有用的，但是没有合适的酶切位点。
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18楼2011-03-30 21:18:27
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by shaquila at 2011-03-30 20:55:16:
帖子在这，楼主有空看看把，都是大家帮忙的http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2941363

刚才大概看了一遍。学了不少东西。呵呵。多谢
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19楼2011-03-30 21:21:19
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lzh860801

金虫 (正式写手)
★ ★
dhd997(金币+2): 鼓励一下 2011-03-31 08:20:49
引用回帖:
Originally posted by yehuanren at 2011-03-30 21:18:27:
没有特殊目的，也是不得已。想尽可能多的切掉没有用的，但是没有合适的酶切位点。

这就怪了 既然想尽可能切掉没用的部分，那那怕是没有适合的酶切位点也是没有问题的啊。
找不到酶切位点，自己把需要的最小的序列找出来，然后设计引物的时候自己设计可以用的酶切位点不就好了么？这样的话你片段的大小就是随你自己控制了。
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20楼2011-03-30 21:31:45
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jjwl_rscn

金虫 (正式写手)
★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
这么多水友啊
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21楼2011-03-31 17:16:43
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zhangyiz

禁虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-17 08:40:29
本帖内容被屏蔽
22楼2011-05-17 00:08:36
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mxlo.o

金虫 (正式写手)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
楼主好啊。我最近做的要转入的片段也有9000bp左右，也是心里没有底。不知道楼主的实验进行的怎么样？有没有一些好的建议可以共享一下。
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23楼2012-05-22 10:41:33
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5501916165楼
2011-03-30 12:42   回复  
yehuanren(金币+1):谢谢参与
香菱儿6楼
2011-03-30 13:59   回复  
yehuanren(金币+1):谢谢参与
。。。。。。 [ Last edited by 香菱儿 on 2011-3-30 at 18:14 ]
牛哥哥10楼
2011-03-30 16:43   回复  
yehuanren(金币+1):谢谢参与
媛媛122314楼
2011-03-30 20:59   回复  
yehuanren(金币+1):谢谢参与
媛媛122315楼
2011-03-30 21:01   回复  
dhd997: 连续顶贴会被视为恶意灌水，下次注意啦。专业不懂的话，欢迎交流，仅仅为一个金币不值得，求助帖子最好不要纯表，有规定的 2011-03-31 08:20:26
媛媛122316楼
2011-03-30 21:03   回复  
91088397417楼
2011-03-30 21:17   回复  
yehuanren(金币+1):谢谢参与
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