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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。
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yehuanren

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。

最近在构建一个载体，最终T-DNA的长度要达到1w bp。请问，这么长的片段，通过农杆菌介导能否顺利的转入植物基因组。听说T-DNA太长的话不好全部转入，有没有哪位同学做过这方面的实验。给点建议！如果盲目的构建将来却转不进去，岂不是很悲催。
      或者， 哪位同学给推荐一个表达载体（质粒），要求：1，质粒较小，目前本人操作的两个载体（pbi121和pksb）都是1.5w bp左右，这也是导致最终T-DNA较长的一个直接原因。2，质粒没有选择标记/抗性标记基因，或者选择标记比较容易切除！如果能找到这样的载体，T-DNA的最终长度会减少很多。
     
     另外还有一个酶切连接的问题。需要在载体中双酶切切去一个片段，然后让剩下的载体大片段自连。现在想了两个方案：1，用平末端连接。2，也是听说平末端比较难连接，试图从该载体中随便pcr扩增一个片段，在上下游引物两端加上我双酶切的那两个酶，然后再和上述的载体大片段连接。觉得第二个办法好笨啊。请问，平末端真的很难操作吗？有做过的同学给点建议吧。在此先谢过了，问题好像比较多啊，菜鸟！我就是一直实验小菜鸟。各位，包含~~

[ Last edited by yehuanren on 2011-3-30 at 01:31 ]
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1楼 2011-03-30 01:01:13
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lzh860801

金虫 (正式写手)
★ ★ ★ ★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
yehuanren(金币+5): 谢谢您，我明天提完质粒就往下做，先试试再说吧，百闻不如一试。呵呵 2011-03-30 20:46:06
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:32
引用回帖:
Originally posted by yehuanren at 2011-03-30 01:01:13:
最近在构建一个载体，最终T-DNA的长度要达到1w bp。请问，这么长的片段，通过农杆菌介导能否顺利的转入植物基因组。听说T-DNA太长的话不好全部转入，有没有哪位同学做过这方面的实验。给点建议！如果盲目的构建将 ...

不知道LZ这个T-DNA是有特殊目的还是怎么的？
如果是有特殊目的非要这么大片段那在片段上就没什么办法了，
载体方面可以换换其他的载体，不过一般做植物转化的载体都不怎么小，除了一些打基因枪这类的载体，但这些并不适合做普通的转化。
另外关于连接的问题，其实平末端与粘性末端在连接上的成功率个人觉得差别不大，感觉平末端连接困难的原因只是因为载体自连的会比较多，这个只需要在做连接的时候加大片段的量就没多大问题了。但是如果是用平末端连接的话，有的时候往往需要考虑方向的正反。
实际上很多东西做起来并没有那么麻烦。LZ试试就知道了
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12楼2011-03-30 19:12:33
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yehuanren

新虫 (初入文坛)

自己顶一个

★
amisking(金币+1): 鼓励发帖交流。 2011-03-30 19:36:57
刚才有查了一些资料。如果是载体片段和目的DNA用平末端连接的话，需要先补平，然后去磷酸化，最后再连接。而且这样还经常出现载体片段自连的现象。一看到载体自连好开心啊，我这个双酶切后本来就是要剩下的片段自连嘛，这样说来，我用平末端是不是要好练一点呢。具体操作又应该如后？？谢谢大家指导
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2楼2011-03-30 02:13:49
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yehuanren

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 香菱儿 at 2011-03-30 13:59:11:
自己试试不就行了？
有发帖顶贴的功夫连接转化都试做一次了

这个高兄说话如此轻松，必定是高手中的高高手，一生也肯定与他人无所求，只是在下不才，实验经历尚浅，纵然百般思虑还是愿意倾听一下同行高人的意见，自是三人必有我师，高君一席话胜读十年书。发此贴也不过此目的而已。并不会因为发帖的须臾功夫而停步实验片刻。您实在多虑了！也谢谢您顶贴，我的实验安排也很好！
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7楼2011-03-30 15:42:39
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shaquila

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-03-30 17:00:26
yehuanren(金币+5): 好的。我这就搜搜看，多谢。有不懂的可能还要劳烦您。呵呵 2011-03-30 20:47:03
yehuanren(金币+26): 2011-04-02 21:04:27
楼主可以搜索我的主题贴，关于线性自连，平端我试过，大家帮助下，挺顺利，但是细节较多，推荐用接头，设计两对引物，直接让它们退火互补，这个是最简单的办法，嘻嘻
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8楼2011-03-30 16:36:28
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香菱儿6楼
2011-03-30 13:59   回复  
yehuanren(金币+1):谢谢参与
。。。。。。 [ Last edited by 香菱儿 on 2011-3-30 at 18:14 ]
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