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yehuanren

新虫 (初入文坛)

应助: 0 (幼儿园)
金币: 239.3
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虫号: 930476

[交流] 【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。

最近在构建一个载体，最终T-DNA的长度要达到1w bp。请问，这么长的片段，通过农杆菌介导能否顺利的转入植物基因组。听说T-DNA太长的话不好全部转入，有没有哪位同学做过这方面的实验。给点建议！如果盲目的构建将来却转不进去，岂不是很悲催。
   或者，哪位同学给推荐一个表达载体（质粒），要求：1，质粒较小，目前本人操作的两个载体（pbi121和pksb）都是1.5w bp左右，这也是导致最终T-DNA较长的一个直接原因。2，质粒没有选择标记/抗性标记基因，或者选择标记比较容易切除！如果能找到这样的载体，T-DNA的最终长度会减少很多。

   另外还有一个酶切连接的问题。需要在载体中双酶切切去一个片段，然后让剩下的载体大片段自连。现在想了两个方案：1，用平末端连接。2，也是听说平末端比较难连接，试图从该载体中随便pcr扩增一个片段，在上下游引物两端加上我双酶切的那两个酶，然后再和上述的载体大片段连接。觉得第二个办法好笨啊。请问，平末端真的很难操作吗？有做过的同学给点建议吧。在此先谢过了，问题好像比较多啊，菜鸟！我就是一直实验小菜鸟。各位，包含~~

[ Last edited by yehuanren on 2011-3-30 at 01:31 ]

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1楼2011-03-30 01:01:13

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shaquila

金虫 (正式写手)

MolEPI: 5
应助: 37 (小学生)
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虫号: 654839

★ ★ ★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
dhd997(金币+2): 欢迎交流 2011-03-30 17:00:26
yehuanren(金币+5): 好的。我这就搜搜看，多谢。有不懂的可能还要劳烦您。呵呵 2011-03-30 20:47:03
yehuanren(金币+26): 2011-04-02 21:04:27

楼主可以搜索我的主题贴，关于线性自连，平端我试过，大家帮助下，挺顺利，但是细节较多，推荐用接头，设计两对引物，直接让它们退火互补，这个是最简单的办法，嘻嘻