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[交流]
【求助/交流】T-DNA全长约10000bp能否转入植物基因组。
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最近在构建一个载体，最终T-DNA的长度要达到1w bp。请问，这么长的片段，通过农杆菌介导能否顺利的转入植物基因组。听说T-DNA太长的话不好全部转入，有没有哪位同学做过这方面的实验。给点建议！如果盲目的构建将来却转不进去，岂不是很悲催。 或者， 哪位同学给推荐一个表达载体（质粒），要求：1，质粒较小，目前本人操作的两个载体（pbi121和pksb）都是1.5w bp左右，这也是导致最终T-DNA较长的一个直接原因。2，质粒没有选择标记/抗性标记基因，或者选择标记比较容易切除！如果能找到这样的载体，T-DNA的最终长度会减少很多。 另外还有一个酶切连接的问题。需要在载体中双酶切切去一个片段，然后让剩下的载体大片段自连。现在想了两个方案：1，用平末端连接。2，也是听说平末端比较难连接，试图从该载体中随便pcr扩增一个片段，在上下游引物两端加上我双酶切的那两个酶，然后再和上述的载体大片段连接。觉得第二个办法好笨啊。请问，平末端真的很难操作吗？有做过的同学给点建议吧。在此先谢过了，问题好像比较多啊，菜鸟！我就是一直实验小菜鸟。各位，包含~~ [ Last edited by yehuanren on 2011-3-30 at 01:31 ] |
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11楼2011-03-30 16:51:04
★ ★ ★ ★
yehuanren(金币+1):谢谢参与
yehuanren(金币+5): 谢谢您，我明天提完质粒就往下做，先试试再说吧，百闻不如一试。呵呵 2011-03-30 20:46:06
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:32
yehuanren(金币+1):谢谢参与
yehuanren(金币+5): 谢谢您，我明天提完质粒就往下做，先试试再说吧，百闻不如一试。呵呵 2011-03-30 20:46:06
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:32
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不知道LZ这个T-DNA是有特殊目的还是怎么的？ 如果是有特殊目的非要这么大片段那在片段上就没什么办法了， 载体方面可以换换其他的载体，不过一般做植物转化的载体都不怎么小，除了一些打基因枪这类的载体，但这些并不适合做普通的转化。 另外关于连接的问题，其实平末端与粘性末端在连接上的成功率个人觉得差别不大，感觉平末端连接困难的原因只是因为载体自连的会比较多，这个只需要在做连接的时候加大片段的量就没多大问题了。但是如果是用平末端连接的话，有的时候往往需要考虑方向的正反。 实际上很多东西做起来并没有那么麻烦。LZ试试就知道了  |
12楼2011-03-30 19:12:33
★ ★ ★
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:49
dhd997(金币+3): good 2011-03-31 08:18:49
| 帖子在这，楼主有空看看把，都是大家帮忙的http://muchong.com/bbs/viewthread.php?tid=2941363 |
13楼2011-03-30 20:55:16
18楼2011-03-30 21:18:27
19楼2011-03-30 21:21:19
话你片段的大小就是随你自己控制了。 20楼2011-03-30 21:31:45
21楼2011-03-31 17:16:43
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-17 08:40:29
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
dhd997(金币+2): 鼓励交流 2011-05-17 08:40:29
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22楼2011-05-17 00:08:36
23楼2012-05-22 10:41:33
简单回复
2011-03-30 12:42
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yehuanren(金币+1):谢谢参与
香菱儿6楼
2011-03-30 13:59
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yehuanren(金币+1):谢谢参与
。。。。。。 [ Last edited by 香菱儿 on 2011-3-30 at 18:14 ]
牛哥哥10楼
2011-03-30 16:43
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yehuanren(金币+1):谢谢参与
媛媛122314楼
2011-03-30 20:59
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yehuanren(金币+1):谢谢参与
媛媛122315楼
2011-03-30 21:01
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dhd997: 连续顶贴会被视为恶意灌水，下次注意啦。专业不懂的话，欢迎交流，仅仅为一个金币不值得，求助帖子最好不要纯表，有规定的 2011-03-31 08:20:26
媛媛122316楼
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91088397417楼
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