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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】粘性末端连接问题
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feiye2214

木虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】粘性末端连接问题 已有4人参与

小弟在做一个连接，质粒大小4.2kb，目的片段1.6kb
质粒中有EcoR I和BamH I酶切位点，1.6kb的PCR片段两端也被设计了这两个酶切位点
我的流程是：把质粒从菌中提出来，PCR片段是扩增得到；然后用两种限制性酶酶切这两个片段，得到具有粘性末端的4.2kb和1.6kb的片段；一定量跑胶之后，割胶提纯目的片段；提纯液用于连接反应

全程都是采用试剂盒

我想问的是：跑胶之后提纯，是不是会损伤DNA啊？尤其是粘性末端！
能不能在酶切之后就连接反应，不要经过提纯这一步（跑胶显示条带单一，没有杂带），那里面的限制性酶会不会影响连接啊？
求高手指点
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1楼 2010-08-08 16:22:48
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
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双酶切后还是要纯化的。不懂你为什么割胶纯化，直接纯化就好了，当做PCR产物一样。
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仕不可不弘毅，任重而道远
2楼2010-08-08 16:41:28
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-08-08 16:41:28:
双酶切后还是要纯化的。不懂你为什么割胶纯化，直接纯化就好了，当做PCR产物一样。

怎么直接纯化，之前没有做过，多谢赐教啊？
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3楼2010-08-08 16:45:20
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
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amisking(金币+4):鼓励热心的虫子。 2010-08-08 18:38:54
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Originally posted by feiye2214 at 2010-08-08 16:45:20:

怎么直接纯化，之前没有做过，多谢赐教啊？

你的pcr产物平时怎么纯化的，应该是用PCR产物纯化试剂盒吧，就用这个试剂盒纯化~
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仕不可不弘毅，任重而道远
4楼2010-08-08 16:47:32
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-08-08 16:47:32:


你的pcr产物平时怎么纯化的，应该是用PCR产物纯化试剂盒吧，就用这个试剂盒纯化~

我平时直接把PCR产物跑胶，没有纯化过，这次是要用到纯化片段，以为要跑胶然后割胶纯化
有试剂盒可以直接纯化酶切后的片段啊？
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5楼2010-08-08 16:50:08
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
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试剂盒有两种，一种是割胶纯化的（麻烦一点）一种是产物纯化的。你要是没有产物纯化试剂盒，割胶的夜没问题啦~
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仕不可不弘毅，任重而道远
6楼2010-08-08 16:59:50
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-08-08 16:59:50:
试剂盒有两种，一种是割胶纯化的（麻烦一点）一种是产物纯化的。你要是没有产物纯化试剂盒，割胶的夜没问题啦~

呵呵，谢谢，我在大连宝生物查到了可以纯化产物的试剂盒了，去酶和dNTP等物质，我准备买这个，不然胶纯化，很伤DNA吧
看你的信息，你是安庆的，你是在安庆读书还是安庆人?我是桐城人，在浙江舟山读书呢
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7楼2010-08-08 17:20:18
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fungixx

至尊木虫 (文坛精英)

优秀版主优秀版主优秀版主
★
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没那么夸张  跑胶回收绝对没有问题的
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几年前踏上火车那一刻都还没有意识到,从此故乡只有冬夏,再无春秋
8楼2010-08-08 18:10:17
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feiye2214

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fungixx at 2010-08-08 18:10:17:
没那么夸张  跑胶回收绝对没有问题的

我跑胶的时候，缓冲液会发热，估计天气的原因很大，是不是外围用冰块降温？
跑胶之后回收，粘性末端不会坏掉？很担心
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9楼2010-08-09 09:09:43
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zzp55zzp

新虫 (初入文坛)
★
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应该是胶回收的问题。
你酶切之后应该用PCR回收的方法纯化了连接
使用胶回收试剂盒的话，引物融化胶的试剂PH很高，加上温度影响，很容易把粘性末端破坏掉，所谓粘性末端不过是很短的，只有几个碱基的单链而已。
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10楼2010-08-09 11:09:07
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