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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分步酶切 回收 求助
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风荻

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
双酶切可能是空间位阻的问题。单酶切分步回收可能会自连，还有就是你酶切的质粒有多少啊，会不会回收效率低，第二次回收后有但看不见了？   你分步酶切一次回收的话，酶要60°以上灭活一下的吧，buffer再加3ul就可了。     祝你成功！！！
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11楼2010-06-30 10:11:12
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weiminhb

铁虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
可以单酶切后用NaAc-无水乙醇沉淀回收，然后用另一个酶酶切
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12楼2010-06-30 10:59:00
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张力民1598

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我怎么记得是H buffer
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13楼2010-06-30 13:16:23
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mark32280667

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
没有那个必要，
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14楼2010-07-01 16:22:09
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mark32280667

新虫 (初入文坛)
多做几次，、、

拿分走人
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15楼2010-07-01 16:22:21
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
以前我也遇到过这样的问题，第一个酶切后过柱子回收损失太多，可以采用乙醇沉淀的方法进行回收。建议先用其中一个酶进行酶切，结束后乙醇沉淀DNA，然后进行第二个酶切，然后胶回收、连接、转化。

附：乙醇沉淀protocol（具体原理可参照分子克隆）

加入0.1倍体积的乙酸钠（3M，pH5.2），然后加入2倍体积的乙醇，混匀后置4℃作用30min，12000rpm离心10min，倒掉上清，余下的沉淀即为DNA,可能肉眼不可见。开盖放置一段时间，让乙醇充分挥发，以免影响后续试验。
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
16楼2010-07-01 16:27:21
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gsf313

铁虫 (小有名气)
非常感谢大家的留言、帮助，我用“月月大可”同学说的方法试做了下，现在成功了，真是非常的高兴和激动啊！！下面的实验，我会继续努力，有问题还会来请教大家！

谢谢小木虫，谢谢各位热心同学，希望大家都能有突破，多发好文章！
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17楼2010-07-01 23:00:47
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混水小虫

金虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
984366楼: Originally posted by 月月大可 at 2010-06-26 12:06:48
可以尝试一下第一次酶切完回收的时候不要电泳，而是直接加入溶胶Buffer，然后挂柱子，一下做法完全按照说明书操作。洗脱的时候小体系。30微升甚至都可以20-25微升，洗下来后全部用于第二次酶切。第二次酶切结束后电 ...

你好！我最近也准备着手做分步双酶切，有个问题想请教一下你。在第一次单酶切后，有没有进行去磷酸化处理啊？还是直接进行纯化回收了？谢谢！！
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期待，美好的生活！！
18楼2012-11-29 21:29:18
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