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风荻

金虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
双酶切可能是空间位阻的问题。单酶切分步回收可能会自连,还有就是你酶切的质粒有多少啊,会不会回收效率低,第二次回收后有但看不见了?   你分步酶切一次回收的话,酶要60°以上灭活一下的吧,buffer再加3ul就可了。     祝你成功!!!
11楼2010-06-30 10:11:12
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weiminhb

铁虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
可以单酶切后用NaAc-无水乙醇沉淀回收,然后用另一个酶酶切
12楼2010-06-30 10:59:00
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张力民1598

铜虫 (小有名气)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
我怎么记得是H buffer
13楼2010-06-30 13:16:23
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mark32280667

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
没有那个必要,
14楼2010-07-01 16:22:09
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mark32280667

新虫 (初入文坛)

多做几次,、、

拿分走人
15楼2010-07-01 16:22:21
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

以前我也遇到过这样的问题,第一个酶切后过柱子回收损失太多,可以采用乙醇沉淀的方法进行回收。建议先用其中一个酶进行酶切,结束后乙醇沉淀DNA,然后进行第二个酶切,然后胶回收、连接、转化。

附:乙醇沉淀protocol(具体原理可参照分子克隆)

加入0.1倍体积的乙酸钠(3M,pH5.2),然后加入2倍体积的乙醇,混匀后置4℃作用30min,12000rpm离心10min,倒掉上清,余下的沉淀即为DNA,可能肉眼不可见。开盖放置一段时间,让乙醇充分挥发,以免影响后续试验。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
16楼2010-07-01 16:27:21
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gsf313

铁虫 (小有名气)

非常感谢大家的留言、帮助,我用“月月大可”同学说的方法试做了下,现在成功了,真是非常的高兴和激动啊!!下面的实验,我会继续努力,有问题还会来请教大家!

谢谢小木虫,谢谢各位热心同学,希望大家都能有突破,多发好文章!
17楼2010-07-01 23:00:47
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混水小虫

金虫 (小有名气)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
984366楼: Originally posted by 月月大可 at 2010-06-26 12:06:48
可以尝试一下第一次酶切完回收的时候不要电泳,而是直接加入溶胶Buffer,然后挂柱子,一下做法完全按照说明书操作。洗脱的时候小体系。30微升甚至都可以20-25微升,洗下来后全部用于第二次酶切。第二次酶切结束后电 ...

你好!我最近也准备着手做分步双酶切,有个问题想请教一下你。在第一次单酶切后,有没有进行去磷酸化处理啊?还是直接进行纯化回收了?谢谢!!
期待,美好的生活!!
18楼2012-11-29 21:29:18
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