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【求助/交流】分步酶切 回收 求助 已有13人参与
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我切一个载体，Ecor I 和 Xho I，宝生物的酶，这两个酶的buffer都是1xk 因为两个酶切位点之间只差6个碱基，所以同时双酶切老是切不开。分步酶切的话，第一次用Ecor I切完，用胶回收试剂盒回收片段，再 Xho I切。第二次回收，总是收不回来片段。 我现在想用30/50ul 体系，先 1ul Ecor I ，3ul 10XK buffer，10ul 质粒，补水到30ul，切三个小时，不回收，直接再加2ul 10XK buffer,1.5ul Xho I，加水补到50ul，再切三小时，大家看可行么？给点建议啊，我快急疯了，眼看就毕不了业了…… 补充一些疑问点：1。第一次酶切后，需不需要加热使酶失活，然后再进行下一步？如果需要，怎么加热？多少度？加热多久？ 2。加第二个酶的时候，10XK buffer 加5ul 还是3ul？ 因为两个酶的buffer一样，所以有此疑问 |
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