应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分步酶切 回收 求助
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 2543  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

gsf313

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】分步酶切 回收 求助 已有13人参与

我切一个载体，Ecor I 和 Xho I，宝生物的酶，这两个酶的buffer都是1xk

因为两个酶切位点之间只差6个碱基，所以同时双酶切老是切不开。分步酶切的话，第一次用Ecor I切完，用胶回收试剂盒回收片段，再 Xho I切。第二次回收，总是收不回来片段。

我现在想用30/50ul 体系，先 1ul Ecor I ，3ul 10XK buffer，10ul 质粒，补水到30ul，切三个小时，不回收，直接再加2ul 10XK buffer,1.5ul Xho I，加水补到50ul，再切三小时，大家看可行么？给点建议啊，我快急疯了，眼看就毕不了业了……

补充一些疑问点：1。第一次酶切后，需不需要加热使酶失活，然后再进行下一步？如果需要，怎么加热？多少度？加热多久？

2。加第二个酶的时候，10XK buffer 加5ul 还是3ul？ 因为两个酶的buffer一样，所以有此疑问
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-06-25 23:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gsf313 at 2010-06-26 09:16:47:

说明书上写了，我们跑胶用的loading buffer就含反应终止成分，但是不知道该怎么加量，加完以后是否需要纯化，这个，有高人知道么？

限制酶配的loading buffer里面有SDS，加了以后酶失活，只能再跑电泳之前用。后面还要酶切的话就不能用

第一次切完最好纯化一下，或者酚氯仿抽提乙醇沉淀，或者过柱子纯化。重新溶了以后再切第二次

酶切位点离得太近的话双酶切切不开很常见，分步切有可能改善，但是跟切的顺序有关。建议你先EcoR I后Xho I和先Xho I后EcoR I都试一下。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2010-06-26 09:58:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

xiangyunch

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一般情况下65度十分钟就可以使酶失活
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-06-26 08:43:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

珊瑚木子

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+1):谢谢交流 2010-06-26 11:13:49
我觉得酶是应该灭一下的，好像在酶试剂说明书上见过有终止反应的试剂，你可以再去看看。
第二次这样加buffer 好像不是可以完全确定到底加多少吧？
或许你可以换一下切得顺序。
不是太懂，接供参考。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-06-26 08:50:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gsf313

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 珊瑚木子 at 2010-06-26 01:50:11:
我觉得酶是应该灭一下的，好像在酶试剂说明书上见过有终止反应的试剂，你可以再去看看。
第二次这样加buffer 好像不是可以完全确定到底加多少吧？
或许你可以换一下切得顺序。
不是太懂，接供参考。

说明书上写了，我们跑胶用的loading buffer就含反应终止成分，但是不知道该怎么加量，加完以后是否需要纯化，这个，有高人知道么？
赞一下 回复此楼
4楼2010-06-26 09:16:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 085602 化工专硕 338分 求调剂 +10 路痴小琪 2026-03-27 10/500 2026-03-28 03:36 by fmesaito
[考研] 材料与化工（0856）304求B区调剂 +7 邱gl 2026-03-27 7/350 2026-03-27 15:27 by Joe率
[考研] 085600材料与化工调剂 +10 A-哆啦Z梦 2026-03-23 16/800 2026-03-27 15:13 by caszguilin
[考研] 0703化学338求调剂！ +6 Zuhui0306 2026-03-26 7/350 2026-03-27 10:35 by shangxh
[考研] 359求调剂 +4 王了个楠 2026-03-25 4/200 2026-03-27 08:43 by 不吃魚的貓
[考研] 317求调剂 +7 蛋黄咸肉粽 2026-03-26 7/350 2026-03-27 02:29 by fmesaito
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +6 13831862839 2026-03-24 7/350 2026-03-26 22:57 by 不吃魚的貓
[考研] 0703化学求调剂 +3 丹青奶盖 2026-03-26 5/250 2026-03-26 20:11 by macy2011
[考研] 一志愿厦门大学化学学硕307求调剂 +8 y7czhao 2026-03-26 8/400 2026-03-26 19:51 by 不吃魚的貓
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +6 谷雨上岸 2026-03-23 7/350 2026-03-26 18:55 by 不吃魚的貓
[考研] 材料考研求调剂 +3 Dendel 2026-03-23 6/300 2026-03-26 17:51 by fmesaito
[考研] 化学调剂一志愿上海交通大学336分-本科上海211 +4 小鱼爱有机 2026-03-25 4/200 2026-03-26 10:19 by aa331100
[考研] 一志愿南航 335分 | 0856材料化工 | GPA 4.07 | 有科研经历 +6 cccchenso 2026-03-23 6/300 2026-03-25 22:25 by 544594351
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 0854AI CV方向招收调剂 +4 章小鱼567 2026-03-23 4/200 2026-03-25 17:04 by CoderLoser
[考研] 285求调剂 +3 AZMK 2026-03-24 3/150 2026-03-25 12:23 by userper
[考研] 材料专硕找调剂 +5 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:07 by 了了了了。。
[考研] 一志愿南航材料专317分求调剂 +5 炸呀炸呀炸薯条 2026-03-23 5/250 2026-03-24 16:52 by 星空星月
[考研] 求调剂 +7 十三加油 2026-03-21 7/350 2026-03-23 23:48 by 热情沙漠
[考研] 求老师收我 +3 zzh16938784 2026-03-23 3/150 2026-03-23 12:56 by ztnimte
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭