应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】分步酶切 回收 求助
北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
51/1返回列表
查看: 2545  |  回复: 17
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

gsf313

铁虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】分步酶切 回收 求助 已有13人参与

我切一个载体，Ecor I 和 Xho I，宝生物的酶，这两个酶的buffer都是1xk

因为两个酶切位点之间只差6个碱基，所以同时双酶切老是切不开。分步酶切的话，第一次用Ecor I切完，用胶回收试剂盒回收片段，再 Xho I切。第二次回收，总是收不回来片段。

我现在想用30/50ul 体系，先 1ul Ecor I ，3ul 10XK buffer，10ul 质粒，补水到30ul，切三个小时，不回收，直接再加2ul 10XK buffer,1.5ul Xho I，加水补到50ul，再切三小时，大家看可行么？给点建议啊，我快急疯了，眼看就毕不了业了……

补充一些疑问点：1。第一次酶切后，需不需要加热使酶失活，然后再进行下一步？如果需要，怎么加热？多少度？加热多久？

2。加第二个酶的时候，10XK buffer 加5ul 还是3ul？ 因为两个酶的buffer一样，所以有此疑问
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2010-06-25 23:56:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ben1147

木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by gsf313 at 2010-06-26 09:16:47:

说明书上写了，我们跑胶用的loading buffer就含反应终止成分，但是不知道该怎么加量，加完以后是否需要纯化，这个，有高人知道么？

限制酶配的loading buffer里面有SDS，加了以后酶失活，只能再跑电泳之前用。后面还要酶切的话就不能用

第一次切完最好纯化一下，或者酚氯仿抽提乙醇沉淀，或者过柱子纯化。重新溶了以后再切第二次

酶切位点离得太近的话双酶切切不开很常见，分步切有可能改善，但是跟切的顺序有关。建议你先EcoR I后Xho I和先Xho I后EcoR I都试一下。
赞一下(2人) 回复此楼
5楼2010-06-26 09:58:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答

xiangyunch

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
一般情况下65度十分钟就可以使酶失活
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2010-06-26 08:43:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

珊瑚木子

铜虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
看天(金币+1):谢谢交流 2010-06-26 11:13:49
我觉得酶是应该灭一下的，好像在酶试剂说明书上见过有终止反应的试剂，你可以再去看看。
第二次这样加buffer 好像不是可以完全确定到底加多少吧？
或许你可以换一下切得顺序。
不是太懂，接供参考。
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2010-06-26 08:50:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

gsf313

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 珊瑚木子 at 2010-06-26 01:50:11:
我觉得酶是应该灭一下的，好像在酶试剂说明书上见过有终止反应的试剂，你可以再去看看。
第二次这样加buffer 好像不是可以完全确定到底加多少吧？
或许你可以换一下切得顺序。
不是太懂，接供参考。

说明书上写了，我们跑胶用的loading buffer就含反应终止成分，但是不知道该怎么加量，加完以后是否需要纯化，这个，有高人知道么？
赞一下 回复此楼
4楼2010-06-26 09:16:47
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 18 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 材料求调剂一志愿哈工大324 +6 闫旭东 2026-03-28 7/350 2026-03-28 04:36 by wxiongid
[考研] 复试调剂，一志愿南农083200食品科学与工程 +5 XQTJZ 2026-03-26 5/250 2026-03-27 14:49 by 狂炫麦当当
[考研] 308求调剂 +7 墨墨漠 2026-03-25 7/350 2026-03-27 14:47 by 狂炫麦当当
[考研] 考研调剂 +9 小蜡新笔 2026-03-26 9/450 2026-03-27 11:10 by 不吃魚的貓
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +6 13831862839 2026-03-24 7/350 2026-03-26 22:57 by 不吃魚的貓
[考研] 求调剂 +5 芦lty 2026-03-25 6/300 2026-03-26 20:49 by 不吃魚的貓
[考研] 081200-11408-276学硕求调剂 +3 崔wj 2026-03-26 3/150 2026-03-26 19:57 by nihaoar
[考研] 求调剂 +8 Auroracx 2026-03-22 8/400 2026-03-26 19:55 by 不吃魚的貓
[考研] 化学工程085602 305分求调剂 +17 RichLi_ 2026-03-25 17/850 2026-03-26 19:44 by plmuchong
[考研] 一志愿211 初试270分 求调剂 +6 谷雨上岸 2026-03-23 7/350 2026-03-26 18:55 by 不吃魚的貓
[考研] 085602化学工程求调剂。 +4 平乐乐乐 2026-03-26 4/200 2026-03-26 17:57 by fmesaito
[考研] 085602 289分求调剂 +8 WWW西西弗斯 2026-03-24 8/400 2026-03-26 16:33 by 不吃魚的貓
[考研] 303求调剂 +6 蓝山月 2026-03-25 6/300 2026-03-25 22:47 by 418490947
[考研] 材料与化工304求B区调剂 +3 邱gl 2026-03-25 3/150 2026-03-25 19:03 by Ainin_
[考研] 求调剂 +3 李李不服输 2026-03-25 3/150 2026-03-25 13:03 by cmz0325
[有机交流] 有机合成求助 20+3 FENGSHUJEI 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:31 by 88817753
[考研] 求调剂 +6 研研，接电话 2026-03-24 7/350 2026-03-24 17:01 by barlinike
[考研] 求调剂一志愿武汉理工大学材料工程（085601） +5 WW.' 2026-03-23 7/350 2026-03-24 14:50 by sprinining
[考博] 26申博自荐 +3 whh869393 2026-03-24 3/150 2026-03-24 09:55 by 21018060
[考研] 一志愿深大，0703化学，总分302，求调剂 +4 七月-七七 2026-03-21 4/200 2026-03-21 18:20 by 学员8dgXkO
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭