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xucan0901

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】4kb片段的连接 已有7人参与

4kb大小的dna片段,我已经连接了3个月了,pMD-18T和其他的表达载体我都连接过,刚开始以为pcr产物浓度不够高,后来我加大pcr的量,还是连接不上,有时候一次提取30个质粒都是假阳性,请问高手怎样才能使4kb的片段连上啊?
在这样下去我快疯了!
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sl19840203

木虫 (小有名气)


看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:02
你是单酶切还是双酶切啊,单酶切注意去磷酸化
2楼2010-07-30 12:58:02
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by sl19840203 at 2010-07-30 12:58:02:
你是单酶切还是双酶切啊,单酶切注意去磷酸化

我是双酶切,ECORI含3个保护碱基,SalI含5个保护碱基。
我一直以为是pcr产物酶切不完全,但是为何连t载体也连不上啊!
3楼2010-07-30 13:25:28
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skkyy88888

铜虫 (著名写手)


看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:13
如果你的PCR产物是TAQ酶扩增在pMD-18T上可以不同酶切直接连接。
4楼2010-07-30 13:36:29
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by skkyy88888 at 2010-07-30 13:36:29:
如果你的PCR产物是TAQ酶扩增在pMD-18T上可以不同酶切直接连接。

这个我知道,有没有那位高手连接过大片段,能不能告诉我注意那些?
5楼2010-07-30 13:41:36
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silicare

荣誉版主 (文坛精英)

合伙创业版兼职版主

优秀版主


看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:28
这么大,必定有突变……

比例你没注意吧,有时候是连接酶效率问题

建议换一个全式金的快速连接T载体
6楼2010-07-30 13:54:07
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zemin_fang

木虫 (正式写手)

xucan0901(金币+1): 2010-07-30 14:32:56
我曾经用T载体连接了10kB的片段
在连接时首先你要确定你用的TAQ酶可以在片段末端加A,另外你的T载体上T没有掉,因为载体上掉T是很常见的情况,所以你要进行对照试验
连接时,确保连接比例在1:3到1:10之间,连接时间稍微延长到5小时左右,便可以连上,我是这样做的
7楼2010-07-30 14:00:55
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by silicare at 2010-07-30 13:54:07:
这么大,必定有突变……

比例你没注意吧,有时候是连接酶效率问题

建议换一个全式金的快速连接T载体

silicare说的可是需要用感受态T1的载体?它只能连接3k以内的片段,需要20分钟左右。4kb的片段连不上。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
8楼2010-07-30 14:40:48
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)

引用回帖:
Originally posted by xucan0901 at 2010-07-30 12:44:24:
4kb大小的dna片段,我已经连接了3个月了,pMD-18T和其他的表达载体我都连接过,刚开始以为pcr产物浓度不够高,后来我加大pcr的量,还是连接不上,有时候一次提取30个质粒都是假阳性,请问高手怎样才能使4kb的片段 ...

我用LA Taq扩的6kb多片段可以连接到T载体(TAKARA,pMD-20)。但同步做的5k和4k的片段没连上,当然也有4k的片段已经成功了。与lz一样,转化后菌落PCR总是假阳性。
我有一个梦想,我梦想有一天,我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力,居住在自己愿意居住的地方。
9楼2010-07-30 14:42:45
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xucan0901

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-07-30 14:42:45:

我用LA Taq扩的6kb多片段可以连接到T载体(TAKARA,pMD-20)。但同步做的5k和4k的片段没连上,当然也有4k的片段已经成功了。与lz一样,转化后菌落PCR总是假阳性。

你的意思是说,大片段的连接只是概率和运气的问题了吗?
10楼2010-07-30 14:46:08
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