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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】目的片段与载体连接不上
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eereer

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】目的片段与载体连接不上 已有11人参与

切胶回收的dna与载体连接转化后质粒PCR出来的结果是一800bp左右的条带，而我的目的片段长约1400。
重复了几次都是这样，哪位高手帮忙解决一下？谢谢
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1楼 2010-11-29 08:48:42
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scelab

荣誉版主 (文坛精英)

小木虫之有关部门负责人
★ ★ ★ ★
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dhd997(金币+3):good 2010-11-29 09:54:14
酶切下质粒试试
PCR不能说明说明问题的，要不你把这800测个序~看看到底是说明原因？有可能是1400的部分呢
分子克隆的东东很邪门，我做的4kb的切胶回收，TA，结果大部分质粒都是连的2kb的雷死我了
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小木虫之有关部门负责人
2楼2010-11-29 08:52:57
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eereer

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by scelab at 2010-11-29 08:52:57:
酶切下质粒试试
PCR不能说明说明问题的，要不你把这800测个序~看看到底是说明原因？有可能是1400的部分呢
分子克隆的东东很邪门，我做的4kb的切胶回收，TA，结果大部分质粒都是连的2kb的雷死我 ...

我做了酶切，结果完全一样，快晕了
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3楼2010-11-29 09:03:43
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feng__

金虫 (著名写手)

雾~蝶
★
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载体和片段都重新处理，没准是哪里污染了
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会不会偶尔也会想起我....
4楼2010-11-29 09:35:51
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若凡2012

银虫 (小有名气)
★ ★
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dhd997(金币+1):鼓励交流 2010-11-29 09:54:29
可以让别人给你P下你的连接产物，有时手气也是个因素，我一同门就这样，很邪乎
。连接的片段一千多，连接的效率确实相对较低，你可以多调些克隆，多P，再就是多做几次连接。
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5楼2010-11-29 09:43:17
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amilie030312

金虫 (正式写手)
是载体自连了吗？然后连的都是空载片段，有没有可能啊？还是像上面说的测下序看看是啥，没准就是你要的目的片段的一部分也说不定呢，还是要用好一点的连接酶的。
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6楼2010-11-29 10:25:07
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zhaohq1209

铁杆木虫 (著名写手)
引用回帖:
Originally posted by eereer at 2010-11-29 08:48:42:
切胶回收的dna与载体连接转化后质粒PCR出来的结果是一800bp左右的条带，而我的目的片段长约1400。
重复了几次都是这样，哪位高手帮忙解决一下？谢谢

lz确定连接之前的PCR产物片段大小正确么？
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我有一个梦想，我梦想有一天，我们的人民可以根据自己的意愿与消费能力，居住在自己愿意居住的地方。
7楼2010-11-29 10:38:57
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天使托

专家顾问 (职业作家)

T.Shen
★
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不知道你切胶回收的dna是1400bp吗？
pcr是一般的验证方法，最保险的方法就是把重组质粒提取出来， 然后酶切，电泳，点上对照，看看大小对不对！
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Whenever,Wherever,Anyway!MustRemember:Fight!KeepFighting!NeverGiveUp!
8楼2010-11-29 11:23:37
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
★ ★
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silicare(金币+1):谢谢参与 2010-11-29 11:46:45
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-29 10:38:57:


lz确定连接之前的PCR产物片段大小正确么？

这个确实要注意，你的PCR和载体在连接之前不是有割胶回收纯化吗，这一步一定要看看大小是否正确，要不然后期工作就白费了。

还有你酶切的时间哪，连接的时间，用的什么条件等等、

你要把自己的情况说的详细一点，清楚一点，这样才比较好解决问题。
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9楼2010-11-29 11:34:08
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eereer

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by zhaohq1209 at 2010-11-29 10:38:57:


lz确定连接之前的PCR产物片段大小正确么？

PCR检验过正常
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10楼2010-11-29 12:47:12
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