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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】目的片段与载体连接不上
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查看: 2002  |  回复: 16
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eereer

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-29 11:34:08:



这个确实要注意，你的PCR和载体在连接之前不是有割胶回收纯化吗，这一步一定要看看大小是否正确，要不然后期工作就白费了。

还有你酶切的时间哪，连接的时间，用的什么条件等等、

你要把自己的情况说 ...

用的takara的PMD-18T,19-Tsimple vector两种质粒都试过，
就直接用的自带 solution 连接时间做过在4度放置12小时和20小时的
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11楼2010-11-29 12:51:47
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piaopiao233

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by eereer at 2010-11-29 12:51:47:



用的takara的PMD-18T,19-Tsimple vector两种质粒都试过，
就直接用的自带 solution 连接时间做过在4度放置12小时和20小时的

你的PCR用的酶是可以末端加A的吧，你连接出来的质粒有没有跑胶，大小对不对，如果对可以直接去测序了。
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12楼2010-11-29 13:19:46
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eereer

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by piaopiao233 at 2010-11-29 13:19:46:



你的PCR用的酶是可以末端加A的吧，你连接出来的质粒有没有跑胶，大小对不对，如果对可以直接去测序了。

连接后的质粒不转化直接电泳？？？
我转化后，煮质粒，PCR，结果显示为800bp左右，做过20个酶切，结果完全一样
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13楼2010-11-29 13:34:00
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tian1203

银虫 (著名写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
以我失败了N次的惨痛经验，感受态有问题，这是最大的可能。感受态自己做的话，control菌少于1000，都很差
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别紧张，我不是什么好人...
14楼2010-11-29 13:43:00
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eereer

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by tian1203 at 2010-11-29 13:43:00:
以我失败了N次的惨痛经验，感受态有问题，这是最大的可能。感受态自己做的话，control菌少于1000，都很差

感受态是买的，而且用过两个公司的了，哭啊
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15楼2010-11-29 13:57:38
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billtsu

木虫 (正式写手)

木木
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请问楼主的实验后来做出来了吗？找到原因了吗，我最近做实验也遇到了类似的问题。
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啊木
16楼2012-08-10 18:53:00
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xuqingchun33

银虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
检查一下酶切位点
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在这个纷绕的世俗世界里，能够学会用一颗平常的心去对待周围的一切，也是一种境界。
17楼2012-08-13 13:21:22
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