24小时热门版块排行榜    

查看: 2387  |  回复: 14
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

xucan0901

铜虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】4kb片段的连接 已有7人参与

4kb大小的dna片段,我已经连接了3个月了,pMD-18T和其他的表达载体我都连接过,刚开始以为pcr产物浓度不够高,后来我加大pcr的量,还是连接不上,有时候一次提取30个质粒都是假阳性,请问高手怎样才能使4kb的片段连上啊?
在这样下去我快疯了!
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zemin_fang

木虫 (正式写手)

xucan0901(金币+1): 2010-07-30 14:32:56
我曾经用T载体连接了10kB的片段
在连接时首先你要确定你用的TAQ酶可以在片段末端加A,另外你的T载体上T没有掉,因为载体上掉T是很常见的情况,所以你要进行对照试验
连接时,确保连接比例在1:3到1:10之间,连接时间稍微延长到5小时左右,便可以连上,我是这样做的
7楼2010-07-30 14:00:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 15 个回答

sl19840203

木虫 (小有名气)


看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:02
你是单酶切还是双酶切啊,单酶切注意去磷酸化
2楼2010-07-30 12:58:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xucan0901

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
Originally posted by sl19840203 at 2010-07-30 12:58:02:
你是单酶切还是双酶切啊,单酶切注意去磷酸化

我是双酶切,ECORI含3个保护碱基,SalI含5个保护碱基。
我一直以为是pcr产物酶切不完全,但是为何连t载体也连不上啊!
3楼2010-07-30 13:25:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

skkyy88888

铜虫 (著名写手)


看天(金币+1):鼓励交流 2010-07-30 14:01:13
如果你的PCR产物是TAQ酶扩增在pMD-18T上可以不同酶切直接连接。
4楼2010-07-30 13:36:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通表情 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 投票:  有多少人是今天查系统知道结果的? +16 爱看书的可乐 2026-08-26 18/900 2026-08-28 05:13 by winsaint
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高,自己申请怎么就这么难 +9 Kittylucky 2026-08-27 9/450 2026-08-28 01:08 by jurkat.1640
[基金申请] 申请删除本帖 +6 lyz123lyz 2026-08-27 7/350 2026-08-27 17:31 by 宁静致远sy
[基金申请] 基金未中,这种答复是模板吗? +5 zhaosm1982 2026-08-27 6/300 2026-08-27 16:00 by lfy8008
[基金申请] 看板上这么多中的,有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +5 叶九微 2026-08-26 5/250 2026-08-27 10:35 by l_zh2008
[教师之家] 售SCI一区文章,我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +3 LIbGuocjEEYw 2026-08-26 4/200 2026-08-27 04:33 by Ie9AyIAvGbvs
[基金申请] 我不理解! +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 2026年的国家社科基金项目通讯评审的新规则与新动向、新挑战 +7 process2012 2026-08-23 10/500 2026-08-26 19:23 by hmhminy
[基金申请] 系统查不到 +10 董八千 2026-08-26 10/500 2026-08-26 16:30 by Equinoxhua
[基金申请] 怎么查啊 +5 huang1991js 2026-08-26 5/250 2026-08-26 16:09 by Equinoxhua
[基金申请] 能否退出参与的面上项目解除限项 +23 koalala 2026-08-24 26/1300 2026-08-26 14:29 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了,中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 今天务委会开完了,明天出结果吗 +19 angus9576 2026-08-25 23/1150 2026-08-26 10:03 by zp519
[基金申请] 在坚冰还盖着北海的时候,我看到了怒放的梅花。 (金币+10) +6 ziyangfang 2026-08-25 9/450 2026-08-25 20:26 by huagongfeihu
[基金申请] 明天应该可查了!? +6 chengyan1220 2026-08-23 6/300 2026-08-25 19:45 by zfd97
[基金申请] 建议基金发布提前给出明确的时间点 +13 kulium 2026-08-21 16/800 2026-08-24 16:27 by superceng
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧? +4 哈哈蛤? 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
信息提示
请填处理意见