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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！
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lijing5221

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题，请各位高手指点！！！已有15人参与

各位高手：
大家好！我的目的片段是200bp左右，打算连接到T载体中，当时目的片段用100ul（2个50ul） PCR反应体系回收得到的，用5ul回收产物跑电泳条带非常亮，然后我用TAKARA的pMD-18T载体做连接，载体和目的片段比例分别是1ul：4ul,  0.5ul: 4.5ul， 0.5ul:1.5ul做了三次连接，用天根的DH5a做的转化，氨苄平板上长菌，而且很多，但挑到液体LB中要么长菌，但没有质粒，要么根本就不长菌，摇不起来，我现在不知道到底是哪里出了问题，请各位高手指点一下，本人非常感谢！！！
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1楼2010-11-01 10:24:37
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sifantong

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
试试用control plasmid 转感受态 看看感受态好不好用
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2楼2010-11-01 11:08:44
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
重新配氨苄平板试试。可能氨苄失效了。
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3楼2010-11-01 11:20:39
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m.c1002

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励交流！ 2010-11-09 19:08:21
可能是氨苄青霉素失效了，氨苄青霉素不能高温高压灭菌
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环境影响人，但人可以选择和创造环境！
4楼2010-11-01 12:55:06
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amilie030312

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-01 18:59:23
先看是不是感受态的问题，如果感受态没问题那就是连接酶的问题了，你之前还做个其他的特殊处理吗？比如酶切啥的，如果都酶问题那就是连接的问题，可能没连上
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5楼2010-11-01 12:56:07
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tian1203

银虫 (著名写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-01 18:59:14
之前和你一样小的片段还行，大的基本不长菌或者假阳性。个人观点：8成是你的感受态做的不好，做个control对照检测感受态
赞一下(2人) 回复此楼
别紧张，我不是什么好人...
6楼2010-11-01 18:48:15
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taigongzaici

新虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
这个情况我遇到过，没有原因，TAKARA连接大片段就是不好，你试试延长时间，多练几次就好了
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7楼2010-11-01 19:24:24
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by taigongzaici at 2010-11-01 19:24:24:
这个情况我遇到过，没有原因，TAKARA连接大片段就是不好，你试试延长时间，多练几次就好了

他的片段只有200bp！
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
8楼2010-11-02 13:47:48
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空谷幽风

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
dhd997(金币+2):鼓励交流。 2010-11-02 14:16:38
可能原因：1:平板抗性失效了
         2：感受态细胞污染了
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a?,c??ae~?a,EURc§?c?μé-,cs,,a‘?é?“i1/4?i1/4?i1/4?i1/4?
9楼2010-11-02 13:55:47
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whblmjj

金虫 (正式写手)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
amisking(金币+1):鼓励交流！ 2010-11-09 19:08:31
个人感觉你是不是连接不成功？因为你说要么没有质粒，要么根本就不长菌，还有氨苄失效我以前遇到过，建议楼主都试一下，逐个排除，祝好运
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10楼2010-11-02 15:04:58
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