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lijing5221

新虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】pMD-18T载体连接出现了问题,请各位高手指点!!! 已有15人参与

各位高手:
大家好!我的目的片段是200bp左右,打算连接到T载体中,当时目的片段用100ul(2个50ul) PCR反应体系回收得到的,用5ul回收产物跑电泳条带非常亮,然后我用TAKARA的pMD-18T载体做连接,载体和目的片段比例分别是1ul:4ul,  0.5ul: 4.5ul, 0.5ul:1.5ul做了三次连接,用天根的DH5a做的转化,氨苄平板上长菌,而且很多,但挑到液体LB中要么长菌,但没有质粒,要么根本就不长菌,摇不起来,我现在不知道到底是哪里出了问题,请各位高手指点一下,本人非常感谢!!!
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m.c1002

金虫 (小有名气)

★ ★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
amisking(金币+2):鼓励交流! 2010-11-09 19:08:21
可能是氨苄青霉素失效了,氨苄青霉素不能高温高压灭菌
环境影响人,但人可以选择和创造环境!
4楼2010-11-01 12:55:06
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sifantong

新虫 (初入文坛)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
试试用control plasmid 转感受态 看看感受态好不好用
2楼2010-11-01 11:08:44
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lixg

铁杆木虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
重新配氨苄平板试试。可能氨苄失效了。
3楼2010-11-01 11:20:39
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
dhd997(金币+1):鼓励交流。 2010-11-01 18:59:23
先看是不是感受态的问题,如果感受态没问题那就是连接酶的问题了,你之前还做个其他的特殊处理吗?比如酶切啥的,如果都酶问题那就是连接的问题,可能没连上
5楼2010-11-01 12:56:07
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